维生素D受体对高糖环境下足细胞凋亡及Caspase-3活化水平的影响及机制

江流芳 劳雅琴 马庆华 赵宗权

(苏州卫生职业技术学院基础部，江苏 苏州 215009)

足细胞过度凋亡是糖尿病肾病发生的重要原因，用高糖处理足细胞是目前常见的研究糖尿病肾病足细胞损伤的体外模型〔1〕。足细胞损伤与肾小球硬化、蛋白尿有关〔2,3〕。维生素D受体(VDR)在多种细胞中存在，与机体内钙磷等的代谢有关，能够调控细胞内多种基因的转录和表达，影响细胞内信号转导，与炎症反应、免疫调节、蛋白尿产生等有关〔4～6〕。研究表明，糖尿病小鼠经VDR基因敲除后，小鼠肾组织中足细胞数量急剧减少，出现蛋白尿、肾小球硬化等病理症状〔7,8〕。本实验旨在探讨VDR对高糖环境下足细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1主要材料 人肾脏足细胞HPC购自中科院细胞库；qRT-PCR试剂盒为美国DBI BIOSCIENCE产品；RNA提取试剂盒为北京BioTeke公司产品；VDR、β肌动蛋白(β-actin)引物由上海生工合成；VDR多克隆抗体为美国abacm产品；信号转导与转录因子(STAT)3多克隆抗体、磷酸化的STAT3(p-STAT3)多克隆抗体为美国BBI Life Science产品；p38多克隆抗体、磷酸化的p38(p-p38)多克隆抗体为美国CTS产品；膜联蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)双染细胞凋亡检测试剂盒为上海凯基公司产品；VDR真核表达载体pcDNA3.1-VDR由上海吉玛构建；重组 γ-干扰素(IFN)为德国Promocell产品；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3活性检测试剂盒为碧云天产品；Lipofectamine2000为美国 Invitrogen产品。

1.2细胞培养及处理 人肾脏足细胞HPC用100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素、10%胎牛血清、10 U/ml重组γ-IFN的RPMI1640培养液培养，培养条件为：33℃，5%CO2培养箱。诱导分化条件为：37℃，5%CO2培养箱，细胞培养液中不添加重组γ-IFN，培养14 d后，分化成熟。实验用足细胞均为分化成熟的足细胞。细胞传代用含有0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液传代。

1.3细胞分组 人肾脏足细胞HPC分为：Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR。其中HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG实验时在细胞培养液中添加30 mmol/L葡萄糖，Con、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR细胞实验时在细胞培养液中添加5.5 mmol/L葡萄糖，pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1所用细胞为转染pcDNA3.1后的足细胞，pcDNA3.1-VDR+HG、pcDNA3.1-VDR所用细胞为转染pcDNA3.1-VDR后的足细胞。人肾脏足细胞HPC培养密度约为60%时，进行细胞转染，步骤参照Lipofectamine2000转染试剂说明书。所有实验用细胞在实验开始前24 h分别用不含血清的细胞培养液同步化处理。细胞转染后24 h，Con、pcDNA3.1、pcDNA3.1-VDR细胞用qRT-PCR、Western印迹测定VDR mRNA和蛋白水平，步骤参照1.4和1.5。

1.4高糖作用后足细胞中VDR mRNA水平检测 VDR mRNA表达水平用qRT-PCR测定。Con、HG细胞培养24 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次后，提取细胞中总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。逆转录合成cDNA，qRT-PCR检测VDR mRNA。程序为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次。引物：VDR 上游：5′-TCCTTCCTCTGCTGGTAT-3′，下游5′-CTCCCTTGGTTAGTGTGGTAG-3′。β-actin上游：5′-CAGTGGGTTGGAGCGAGCAT-3′，下游5′-GGACTTCCTGTAACAACGCATCT-3′。2-△△Ct法计算VDR mRNA表达，β-actin为内参。实验重复3次，取均值。

1.5高糖作用后足细胞中VDR 蛋白水平检测 VDR蛋白水平用Western印迹法测定。Con、HG细胞培养24 h，提取细胞总蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法测定各组足细胞总蛋白浓度。用12%分离胶和5%浓缩胶电泳。将蛋白与同体积的上样缓冲液在100℃孵育5 min。每个上样孔添加40 μg蛋白样品，80 V电压在浓缩胶中电泳(约0.5 h)，120 V电压在分离胶中电泳(约2 h)。90 V恒压转膜，转膜时间约为1.5 h。把膜放在含有封闭液(5%牛血清白蛋白)中的薄膜袋，室温孵育1 h。PBS加吐温20(PBST)洗涤后，把膜放在含有稀释好的一抗(VDR 1∶800稀释，β-actin：1∶1 000稀释)薄膜袋中，4℃过夜。PBST洗涤，把膜放在含有1∶3 000稀释的二抗中，室温孵育2 h。PBST洗涤，用ECL显色。凝胶成像仪扫描图像，用Image J分析各条带的灰度值，以β-actin为内参，分析VDR蛋白水平。实验重复3次，取均值。

1.6细胞凋亡测定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG细胞培养24 h，用Annexin V-FITC/PI双染法测定细胞凋亡。收集各组细胞，加入胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心10 min，弃除上清，PBS洗涤2次细胞后，在细胞中加入Annexin V-FITC结合缓冲液195 μl，混合均匀，再添加Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，在室温中孵育20 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.7Caspase-3活性测定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG细胞培养24 h，收集细胞，用比色法测定细胞中Caspase-3的活性。收集细胞，加入细胞裂解液，在冰上裂解10 min，4℃，12 000 r/min离心10 min。取上清溶液，对蛋白进行定量。在蛋白上清中添加入2×反应缓冲液，再加入5 μl AC-DEVD-pNA，37℃孵育60 min。用酶标仪测定405 nm的光密度(OD)值，以OD值表示Caspase-3的活性。

1.8STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白表达测定 Con、HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG细胞培养24 h，收集细胞检测STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平。STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平检测用Western印迹法，步骤同1.5，其中一抗稀释倍数为：STAT3(1∶600)、p-STAT3(1∶500)、p38(1∶600)、p-p38(1∶500)。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析及LSD-t检验。

2 结 果

2.1高糖作用后足细胞中VDR的表达 HG细胞中VDR mRNA和蛋白水平(0.51±0.06，0.38±0.04)与Con相比(1.00，1.12±0.13)明显降低(P<0.05)。见图1。

2.2转染后细胞中VDR的表达 pcDNA3.1细胞中VDR mRNA和蛋白水平与Con相比没有明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。pcDNA3.1-VDR细胞中VDR mRNA和蛋白水平与Con相比明显升高(P<0.05)。见图2和表1。

图1 Western印迹检测高糖作用后足细胞中VDR的蛋白水平

表1 细胞中转染pcDNA3.1-VDR后足细胞中VDR mRNA和蛋白水平

与Con相比：1)P<0.05

图2 Western印迹检测细胞中转染pcDNA3.1-VDR后足细胞中VDR蛋白水平

2.3VDR对高糖诱导细胞凋亡和Caspase-3活化的影响 HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG细胞凋亡率明显高于Con，细胞中Caspase-3活化水平也明显高于Con(P<0.05)。pcDNA3.1-VDR+HG细胞凋亡率、Caspase-3活化水平明显低于HG(P<0.05)。见图3和表2。

图3 流式细胞术测定VDR对高糖诱导的足细胞凋亡影响

表2 过表达VDR后经高糖作用的足细胞凋亡率及Caspase-3活性

与Con相比：1)P<0.05；与HG相比：2)P<0.05；下表同

2.4VDR对高糖作用后足细胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白表达的影响 HG、pcDNA3.1+HG、pcDNA3.1-VDR+HG细胞中p-p38水平、p-STAT3水平明显高于Con(P<0.05)。pcDNA3.1-VDR+HG细胞中p-p38水平、p-STAT3水平明显低于HG(P<0.05)。见图4和表3。

图4 Western印迹测定VDR对高糖作用的足细胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平影响

表3 VDR过表达后经高糖作用足细胞中STAT3、p-STAT3、p38、p-p38蛋白水平

3 讨 论

有研究报道，维生素D参与慢性肾脏病的发生和发展，维生素D的缺乏与糖尿病肾病的发生有关，慢性肾脏患者使用维生素D类的药物可有效降低尿白蛋白肌酸酐比〔9,10〕。VDR属于一种转录调控因子，可以特异性结合维生素D代谢产物，是维生素D的受体，其在肾脏组织中广泛表达，肾小球上皮细胞、足细胞、肾小球旁器等中均发现有VDR的表达〔11,12〕。以前的研究报道，糖尿病小鼠VDR基因敲除后，小鼠产生的血管紧张素、肾素等异常增加，并且小鼠出现严重的肾组织损伤，伴随有肾脏间质纤维化、蛋白尿等症状，小鼠肾组织中足细胞大量凋亡〔7,13〕。本实验说明VDR参与糖尿病肾病的发生，与上述实验报道符合。

最初的研究显示，肾小球肥大、系膜细胞增生、基底膜增厚等是糖尿病肾病早期的主要病理变化，然而随着研究的不断深入，人们发现在糖尿病肾病的早期，足细胞数量异常减少，细胞间的间隙也不断增加，并且在蛋白尿的发生中具有关键作用〔14〕。高糖诱导足细胞损伤，足细胞在糖尿病肾病中凋亡异常增加。Caspase-3在正常状态下以酶原的状态广泛存在于组织中，在受到细胞因子的作用后，细胞中Caspase-3活化，发挥凋亡促进的作用〔15,16〕。本实验结果说明VDR可以降低高糖对足细胞凋亡的诱导作用。

STAT3是STATs家族成员之一，是细胞内重要的信号转导通路，STAT3磷酸化后形成二聚体进一步转移到细胞核内调控基因的转录和表达，影响细胞的生长、凋亡等一系列过程〔17〕。STAT3在糖尿病肾病组织中磷酸化水平异常升高，在高糖诱导的足细胞中STAT3磷酸化水平也异常升高〔18〕。p38是MAPK亚类之一，与糖尿病肾病的发生有关〔19〕。研究显示，p38在糖尿病患者肾组织中的磷酸化水平升高，并且与糖尿病肾病肾组织中的细胞凋亡有关〔20〕。本实验结果说明VDR对足细胞凋亡的影响与细胞中STAT3和p38磷酸化水平有关。综上，高糖促进足细胞中VDR的表达，并且VDR可以降低高糖诱导的足细胞凋亡，STAT3和p38磷酸化水平的高低可能与VDR的作用机制有关。

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