溶血性嗜水气单胞菌XF-6的分离鉴定及其对鲥鱼机体免疫功能的影响

阎 华，王 会，于 博*，黄升谋，李云捷，吴进菊，李玉奇

(1.湖北文理学院化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053；2.襄阳市中心医院，湖北 襄阳 441053)

【研究意义】鲥鱼属于长江三鲜，其肉质鲜美，成为餐桌上的美食，其野生资源因为气候变化和人为因素影响，已经逐渐减少。鲥鱼为滤食性鱼类，主要以浮游生物为主食，有时亦食硅藻及其它有机物的碎屑。目前湖北省长江沿线已形成了具有相当规模的养殖产业，但养殖场主片面追求经济效益，高密度养殖和高蛋白饵料投喂鲥鱼，造成鲥鱼生长环境恶化，并且忽视了预防疾病措施，使得鲥鱼传染性疾病比较严重，有些养殖场发病率高达60 %以上。【前人研究进展】近期湖北省武汉市一些养殖场爆发鲥鱼疾病，其体表出现溃疡，严重者口鼻充血、流血，解剖后内脏肝、脾、肾肿大。经过细菌分离鉴定主要是嗜水气单胞菌的感染。嗜水气单胞菌为革兰阴性菌，属于气单胞菌科，气单胞菌属，广泛分布于水体环境，是引起鱼类运动性气单胞菌败血症的主要病原体[1]。嗜水气单胞菌目前已经发现存在2种溶血性毒素，分别是溶血素和气溶素，分别由ahh1和aerA基因编码[2]。嗜水气单胞菌中溶血性毒素会导致细胞内容物泄漏，最终引发寄主细胞死亡。鲥鱼血液中矿质元素铁可以和蛋白质合成血红蛋白，有助于红细胞输送氧气和二氧化碳，同样有助于免疫系统发挥作用，提高巨噬细胞的杀菌作用。而矿质元素铁也是病原微生物的生长必须元素，有助于提高生长速度。基于此，水产动物通过调控矿质元素铁相关基因表达和调节血液铁元素浓度，从而抑制病原微生物的生长。铁调素蛋白主要由hepc基因表达，在鱼体肝细胞中产生的抗菌肽，抑菌活性很强，这种蛋白主要和机体铁元素联合作用，因此其含量和铁元素浓度有着重要的关系[3]。白细胞介素炎症因子主要由il-6基因编码，激活JAK3/STAT3(蛋白酪氨酸激酶/转录激活因子)信号通路从而促进铁调素基因表达，有助于铁调素发挥生物学功能，从而调节机体免疫功能[4]。【本研究切入点】本试验通过平板划线培养的方法对染病鲥鱼中溶血性嗜水气单胞菌XF-6的分离纯化鉴定，进而检测健康鲥鱼感染嗜水气单胞菌XF-6后对其机体铁元素浓度变化和肝脏中hepc、il-6、jak3和stat3基因表达情况进行分析，研究了溶血性嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼对其免疫系统的影响，【拟解决的关键问题】明确铁元素相关基因和铁元素浓度在受感染鱼体应对嗜水气单胞菌XF-6侵染中的具体功能。

1 材料与方法

1.1 病料与病原菌的分离

染病鲥鱼典型病症为败血症，其主要症状为行动迟缓和反应迟钝，摄食较少，严重的鱼体口鼻充血和腹部出血。鱼体解剖后可见其肝脏肿大，肾脏、肠道充血。在无菌条件下从染病鲥鱼的肝脏取样，营养琼脂平板划线分离，30 ℃培养24 h，目测菌落生长情况，光滑、微凸、圆整、黄色或淡黄色，判定为疑似菌落。然后挑取单菌落在气单胞菌选择培养基上进行二次纯化，纯化后的菌落进行革兰氏染色镜检。分离培养获取的菌株低温保存备用。

1.2 病原菌鉴定方法

病原菌生理生化和革兰氏染色以及氧化酶检测均使用法国梅里埃生物公司鉴定试剂条开展，在VITEK-32 全自动细菌鉴定仪上进行操作。

瓷器画上构图，需要去掌握新彩的独特料性，装饰手法上也可以拜托很多工艺上的局限性，这样会给装饰带来很多自由随性且灵动感十分强烈的绘画风格，从而也能形成自己独特绘画风格。由于不同的装饰对象，所以对于表现手法也要根据不同题材来做改变。当对新彩料性有一定程度掌握，那绘画的起稿也能较为灵活的变动。从而使料可以适应自我的感官表达，达到最理想的表达手法。

1.3 化学试剂和生物试剂盒

化学试剂从上海一基实业有限公司购买，生物试剂盒从上海英诺生物科技有限公司购买。引物和反应条件是根据前人描述的方法[5]。引物是由大连宝生物工程公司合成见表1。

1.4 实验菌株DNA提取

PCR反应包括3对引物。PCR反应溶液(25 μl)包含:12.5 μlTaq酶，1.0 μl ahh1引物，1.0 μl aerA引物，0.2 μl 16 SrRNA引物和1 μl提取DNA，余量为双蒸水。 PCR仪器(ABI-2720，美国贝登仪器公司)扩增，采用下列条件:初始变性95 ℃，5 min。95 ℃,30 s，59 ℃,30 s，72 ℃，30 s，35个循环周期,最后72 ℃条件下延伸10 min。扩增的DNA片段使用2 %琼脂糖凝胶进行水平电泳，1×TAE缓冲区(0.04 M Tris,0.02 M醋酸,0.002 M Na2EDTA),100 V,45 min,使用8 μlPCR产物。凝胶使用1μl/mL溴化乙锭染色30 min,紫外线光照下观察。基因大小标准品是采用100个碱基对的DNA梯度标记物(上海启发试验试剂有限公司)。

如表3所示,电池两端电压的下降值跟随停充时间的延长而加大,给予越长的间歇时间,锂离子电池的端电压下降得越厉害,若供给的停充时间太长,又达不到快速充电的目标。停充对正恒流与负脉冲的切换具有缓冲效果,还在一定程度上去除电池的极化效应,同时还实现了去极化的目的。

1.5 PCR条件

细菌DNA制备方法是根据制造商的DNA提取试剂盒产品说明书(北京普洛麦格生物技术有限公司)开展。

根据《高压直流换流站设计技术规定》(DL/T 5223—2005)，换流站阀厅结构安全等级为一级，结构重要性系数1.1。

1.6 试验用健康鲥鱼

健康鲥鱼从湖北省农科院水产养殖基地购买获取，选择外表健康的鲥鱼幼体，幼鱼平均重量是100 g，平均长度是20 cm。然后将健康鲥鱼随机划分为试验组和对照组，每组有3个平行，每个平行有50尾，总计300尾。

1.7 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼实验和收集实验样本

将低温保存的嗜水气单胞菌XF-6菌株使用平板富集培养基30 ℃培养24 h后，以0.65 %高温高压灭菌的生理盐水稀释成4.0×105cfu/mL的菌体，使用一次性注射器往实验组鲥鱼腹腔注射0.1 mL的菌体。对照组注射0.1 mL的高温高压灭菌的0.65 %生理盐水。注射完成后6，12，24，48，72，84，96 h每个平行收集3尾鲥鱼，使用一次性注射器从鲥鱼尾部静脉抽血0.5～0.8 mL。抽血后鲥鱼进行解剖，获得肝脏置于-80 ℃液氮中保存，用于后续研究。

1.8 血液中铁元素浓度和载铁蛋白浓度的检测

从图3可以看出，鲥鱼受侵染后6～96 h时试验组和对照组相比较，血液铁元素浓度出现减少，12，24和48 h时达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。

1.9 肝脏铁元素浓度的检测

作为农垦首家派驻纪检机构，纪检组积极转换思想，牢记责任使命，找准职责定位，理清工作思路，以嵌入工作开展监督执纪，认真履行工作职责。

1.10 鲥鱼肝脏中铁元素调控基因表达研究

本研究中相关数据使用SPSS18.0软件开展分析，以t检验法来探讨差异显著性，P<0.01显示为差异极显著(以**表示)，P<0.05显示为差异显著(以*表示)[10]。本研究中相关数据均显示为平均值±标准差。

表2 鲥鱼铁代谢相关基因荧光定量PCR引物序列

图1 染病鲥鱼肝脏中分离得到的细菌XF-6培养形态Fig.1 Bacterial culture morphology of strain XF-6 isolated from infected fishes

1.11 统计学计算相关数据

以鲥鱼hepc基因cDNA序列、il-6基因cDNA序列，jak3基因cDNA序列、草鱼stat3基因cDNA序列设计相关引物(表2)[7-9]。使用RNAiso提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)制备鲥鱼肝脏总RNA，再反转录成cDNA，实时定量仪(T-100，美国伯乐仪器有限公司)中对这几个基因序列进行QR-PCR。这4种基因的相对表达量采用2分法进行计算，以鲥鱼18SrRNA基因的表达量为基准。QR-PCR反应溶液包含：10.0 μlTaq酶，0.4 μl引物，2 μl cDNA模板，7.2 μl ddH2O，总体积20 μl。采用下列条件进行扩增：初始变性95 ℃，1 min；95 ℃变性5 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s；循环35个周期；每个样本溶解曲线从52～99 ℃平行检测3次。

取100 mL山羊乳85℃灭菌15 min，冷却至45℃，接种乳酸菌，42℃发酵后4℃冷藏12 h，沸水浴灭酶10 min，4℃ 4 000×g离心10 min，取上清液，4℃冷藏备用。

2 结果与分析

2.1 菌落特征

从图5可以看出，嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后6～96 h时试验组和对照组相比较，肝脏铁元素浓度出现增加，但是没有达到差异显著(P>0.05)。

M:DNA标准品，1:嗜水气单胞菌XF-6 图2 染病鲥鱼分离得到的溶血性嗜水气单胞菌XF-6多重PCR检测Fig.2 Multiplex PCR assay of hemolytic disease shad Aeromonas hydrophila XF-6

2.2 生理生化反应及鉴定结果

经纯化分离后的致病病原菌XF-6，使用VITEK-32全自动细菌分析仪进行生理生化特征操作，鉴定结果为嗜水气单胞菌，生理、生化特性具体见表3。

2.3 嗜水气单胞菌XF-6溶血性毒素因子ahh1和aerA的基因分析

从图2可以看出，经过多重PCR检测证实,从染病鲥鱼中分离得到的嗜水气单胞菌XF-6携带有ahh1和aerA基因。该细菌16srRNA基因PCR扩增产物(439个碱基对) ，ahh1基因扩增产物(153个碱基对)，aerA基因扩增产物(314个碱基对)。

使用干法消化的方法测定肝脏铁元素浓度[6]：鲥鱼肝脏解冻完成后，使用高温高压灭菌的生理盐水冲洗3次，然后使用滤纸吸干，称重后放入瓷干锅，以600 ℃高温马弗炉灼烧约5 h，样本出现白色或者灰白色时，自然冷却到室温取出来，然后加入1︰1的硝酸水混合溶液5 mL，电炉上消化至沸腾，使用滤纸过滤消化液流入50 mL容量瓶，再以双蒸水反复冲洗坩埚以及滤纸，使用滤纸过滤流入上述容量瓶，最后使用双蒸水定容至刻度，检测备用。使用ICP-AES仪(ICP-8000，北京达丰瑞仪器有限公司)重复测定上述样本3次。

表3 菌株XF-6生理生化特性

* 显著性差异(P<0.05)图3 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后不同时间点血清铁浓度的变化Fig.3 Changes of serum iron concentration of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

图4 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后不同时间点血清总铁结合力的变化Fig.4 Changes of total iron binding capacity in serum of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

2.4 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后其血液铁元素浓度的变化

血液铁元素浓度和载铁蛋白浓度的检测是根据制造商的血液铁元素浓度和载铁蛋白浓度检测试剂盒的产品说明书开展(武汉利乐生物工程有限公司)。以紫外分光光度计(TU-1900，北京普析通用仪器有限公司)重复测定样本3次。

2.5 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后其血液载铁蛋白浓度的变化

从图4可以看出，鲥鱼受侵染后6～96 h血液载铁蛋白浓度实验组和对照组相比较，载铁蛋白浓度有所增加，但是均没有达到差异显著(P>0.05)。

2.6 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后其肝脏铁元素浓度的变化

从染病鲥鱼的肝脏样本中分离得到一株致病病原菌，命名为XF-6，24 h营养琼脂平板培养基上可见其菌落为黄色、湿润，圆形，略隆起、边缘整齐，并带有特殊芳香气味，革兰氏染色为阴性杆菌(图1)。

图5 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后不同时间点肝脏铁浓度的变化Fig.5 Changes of hepatic iron concentration of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

2.7 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后其肝脏hepc、il-6、jak3、stat3基因表达的变化

从图6可以看出，鲥鱼受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，其肝脏hepc基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，6 h时增加量最大，6、12、24 h时达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。其肝脏il-6基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，24 h时增加量最大，12、24、48 h时达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。其肝脏jak3基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，12 h时增加量最大，12、24 h达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。其肝脏stat3基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，6 h时的增加量最大，6、12、24 h时达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。

3 讨 论

采用平板划线培养的方法对染病鲥鱼肝脏进行致病菌的分离纯化，在营养琼脂平板上获得形态完全一致的菌落，将该菌株命名为XF-6。全自动细菌分析仪鉴定结果为嗜水气单胞菌。嗜水气单胞菌XF-6人工感染鲥鱼试验，出现的症状与自然病例基本相同，再鉴定的菌株与接种菌株完全一致，所观察到的菌落形态也基本相符。该菌具有溶血性嗜水气单胞菌的典型特征，能分泌具有溶血性、肠毒性和细胞毒性的毒素因子，并能广泛地侵袭健康鲥鱼肾、脾、肺、肝、肌肉和血液等组织器官，造成广泛性出血和全身性器官病变，包括出现肿胀、颗粒变性、玻璃样变，坏死崩解以及红细胞破裂。染病鲥鱼肉眼观察体表出现溃疡、疤痕，严重的产生口鼻充血、流血，解剖后其内脏肝、脾、肾肿大，肠道充血。在最近几年，多重PCR由于其具有速度快，高敏感性和特异性等特点，已经成为检测病原体首选的方法[11]。在本研究中，使用特定的ahh1和aerA引物证实了嗜水气单胞菌XF-6携带有气溶素和溶血素基因，从而为其特征性疾病鉴定奠定良好的基础。

从根本属性上来说，教师生态系统是不断变化并能够自我调节的非完全人工生态系统。教师个人的专业发展需要有机协调好系统当中内部与外部生态环境间的关系。在内部环境中，教师的专业能力、理论知识、心理素养、职业操守等都将会直接影响他们的专业发展。而在外部环境中，院校环境(校内环境、管理机制、教师团队文化等)与校外环境(社会政治、文化、经济以及相关英语研究机构的综合水平及服务水平等)同样会影响广大教师的专业发展。因此，高职英语教师需要协调好个人、院校、社会之间的关系，明确个体与集体的利益关系，精准找到现阶段与未来发展之间的平衡点，只有这样，才能确保自身专业发展的可持续性。

* 显著性差异(P<0.05)图6 嗜水气单胞菌XF-6侵染鲥鱼后不同时间点hepc,il-6,jak3,stat3基因表达的变化Fig.6 hepc,i-6, jak3, stat3 gene expression changes of Aeromonas hydrophila XF-6 infection at different time points

鲥鱼血液中铁元素可以参与机体多种酶类的合成，同时也合成血红蛋白，作为氧气和二氧化碳运输载体，同时也有助于免疫系统发挥作用，提高巨噬细胞的吞噬作用。而矿质元素铁也是病原微生物生长必需元素，有助于提高其生长速度。致病菌和寄主鲥鱼之间通过竞争作用，可以在铁元素浓度上面达到平衡状态。通过铁元素相关基因调节作用，减少机体游离铁元素浓度，增加结合铁元素浓度，从而降低致病菌的生长速度以减少其危害程度。本试验对鲥鱼机体铁元素浓度和载铁蛋白浓度的比较表明，鲥鱼受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，其血液鲥鱼血液铁元素浓度减少，12、24、48 h时达到差异显著；鲥鱼肝脏铁元素浓度有所增加，但是没有达到差异显著。这证明鲥鱼受到病原菌侵染后，可以进行自我调节，减少机体的铁元素循环作用，从而抑制病原菌的生长。鲥鱼受到病原菌侵染后其血液载铁蛋白浓度有所增加，但是和对照组比较没有达到差异显著。综合分析，血液铁元素浓度和载铁蛋白浓度的比值显著降低，从而降低嗜水气单胞菌XF-6生长过程中从鲥鱼体内获取铁元素的能力。

本研究检测到鲥鱼受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，其肝脏hepc、il-6、jak3和stat3基因表达量显著增加，证明这些基因有助于鲥鱼机体的免疫反应，具有免疫调节作用，从而调控体内铁元素浓度。hepc基因的表达产物有助于抑制肠道铁元素的吸收和肝脏铁的释放以降低游离铁元素浓度。前人研究发现，大菱鲆受到嗜水气单胞菌侵染后，肝、脾、鳃等组织器官hepc基因的表达量在几个小时内有显著性提高。鲈鱼受到链球菌侵染后，肝细胞hepc基因mRNA水平在几个小时内明显增加。香鱼受到鳗利斯顿氏菌侵染后，肝脏中hepc基因表达量在几个小时内显著增加[10-12]。本研究实验结果和前人比较一致，hepc基因在受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，表达量有所增加，6、12、24 h时达到差异显著。同样，鲥鱼受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，免疫细胞会第一时间合成和分泌白细胞介素6(il-6)炎性因子，其浓度大小和受感染程度密切相关。il-6炎性因子通过免疫应答作用调控hepc基因的表达水平，从而控制鲥鱼铁元素浓度。il-6炎性因子结合小分子受体后可激活jak3基因，然后激活stat3基因，最后调控hepc基因的表达。本研究结果表明，鲥鱼受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，其肝脏il-6基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，24 h时增加量最大，12、24、48 h时达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。其肝脏jak3基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，12 h时增加量最大，12、24 h达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。其肝脏stat3基因在6～96 h时和0 h时的表达量比较出现增加，6 h时的增加量最大，6、12、24 h时达到差异显著(P<0.05)，但未达到差异极显著(P<0.01)。上述结果表明，鲥鱼受到嗜水气单胞菌XF-6侵染后，其机体发生炎症反应，il-6基因影响到jak3和stat3基因的表达，最后hepc基因的表达量增加，从而调控机体铁元素浓度，降低病原菌生长速度，减少其危害程度。

4 结 论

染病鲥鱼肝脏中分离得到病原菌XF-6，经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定结果为嗜水气单胞菌。采用多重PCR方法确认嗜水气单胞菌XF-6属于溶血性嗜水气单胞菌，含有气溶素基因(aerA)和溶血素基因(ahh1)。侵染嗜水气单胞菌XF-6后，鲥鱼血清中铁浓度明显降低，在12、24、48 h时显著低于对照组；血清中总铁结合力有所上升，但没有达到显著水平；肝脏中铁浓度相对于对照组没有达到显著性差异水平，但仍有升高。肝脏中hepc基因的表达量在6、12、24 h时显著上升；肝脏中il-6基因的表达量在12、24、48 h时显著上升、肝脏中jak3基因的表达量在12、24 h时显著上升，肝脏中stat3基因的表达量在6、12、24 h时显著上升。

参考文献：

[1]Janda J M, Abbott S L. The genusAeromonas：taxonomy, pathogenicity and infection[J]. Clin Microbiol Rev, 2010, 23(1): 35-73.

[2]Sunee K, Suwat D, Rungrawan C, et al. Distribution ofAeromonashydrophilaSerogroups in different clinical samples and the development of polyclonal antibodies for rapid identification of the genusAeromonasby direct agglutination[J]. Microbiol Immunol, 2002, 46(12)：875-879.

[3]Grim C J, Kozlova E V, Sha J, et al. Characterization ofAeromonashydrophilawound pathotypes by comparative genomic and functional analyses of virulence genes[J]. Microbiology, 2013, 4(2)：64-73.

[4]Ansary A, Haneef R M, Torres J L, et al. Plasmids and antibiotic resistance inAeromonashydrophilaisolated in Malaysia from healthy and diseased fish[J]. J Fish Dis, 1992, 15(2)：191-196.

[5]González-Serrano C J, Santos J A, García-López M L, et al. Virulence markers inAeromonashydrophilaandAeromonasveroniibiovar sobria isolates from freshwater fish and from a diarrhoea case[J]. J Appl Microbiol, 2002, 93(3)：414-419.

[6]Subashkumar R, Thayumanavan T, Vivekanandhan G, et al. Occurrence ofAeromonashydrophilain acute gasteroenteritis among children[J]. Indian J Med Res, 2006, 123(1)：61-66.

[7]储卫华, 陆承平. PCR 扩增特异性16S rDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[J]. 水产学报，2005，29(1)：79-82.

[8]王远微，汤 承，于学辉，等. 三重 PCR 检测水产致病性嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[J]. 微生物学报，2008，48(7)： 947-951.

[9]Chen Q，Yan Q，Wang K，et al．The portal of entry for pathogenicVibrioalginolyticusintoPseudosciaenecroceaand characteristic of the bacterial adhesion to the mucus[J]. Dis Aqu Organ, 2008, 80: 181-188.

[10]郭松林，关瑞章，柳佩娟．双重PCR法快速检测欧鳗鲡嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[J].集美大学学报: 自然科学版，2007，12(4)： 294-300.

[11]Shemesh M，Tam A，Steinberg D．Differential gene expression profiling ofStreptococcusmutanscultured under biofilm and planktonic conditions[J]. Microbiology, 2007, 153: 1307-1317.

[12]毛 宁，王志明，郑 莺，等. 嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)与其拮抗菌R-15的生长曲线研究[J]. 福建师范大学学报：自然科学版，2008，24(1)：82-85.