TLRs/MyD88与痛风性关节炎的相关性研究

刘静　谢克琴　曹跃朋　刘正奇　邓志勇　李贺　孙贵炎

【摘 要】目的：研究Toll樣受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）与痛风性关节炎患者临床及实验室指标的相关性。方法：选取120例痛风性关节炎患者，其中急性痛风性关节炎患者（急性组）76例，非急性痛风性关节炎患者（非急性组）44例；另选取健康者20例为健康对照组。记录所有患者的一般情况、病程、疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分，检查肾功能、C-反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR），酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测TLR2、TLR4、MyD88在外周血的浓度，采用SPSS 22.0软件分析痛风性关节炎患者的外周血TLR2、TLR4、MyD88与各指标的相关性。结果：①痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88浓度较健康对照组显著升高，差异有统计学意

义（P < 0.01）；急性组患者外周血TLR2、TLR4、MyD88浓度较非急性组明显升高（P < 0.01）。②病程< 1年、1～5年、5～10年、> 10年的患者外周血TLR2、TLR4、MyD88比较，病程 < 1年的患者外周血TLR2、TLR4高，差异有统计学意义（P < 0.05）；其他病程段的痛风患者两两比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。急性组患者VAS评分、ESR、CRP高于非急性组，差异有统计学意义（P < 0.01）。非急性组患者外周血尿酸高于急性组，差异有统计学意义（P < 0.05）；2组尿素氮、肌酐、胱抑素C比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。④痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88与CRP、ESR呈线性正相关（P < 0.01或P < 0.05）。结论：TLR2、TLR4、MyD88参与了痛风性关节炎患者的发生、发展，尤其在急性期。

【关键词】 痛风性关节炎；Toll样受体；髓样分化因子88；相关性

【ABSTRACT】Objective：To study the correlation between clinical and laboratory indexes of TLR2， TLR4 and MyD88 in patients with gouty arthritis.Methods：One hundred and twenty cases of gouty arthritis were divided into an acute group（76 cases）and a non-acute group（44 cases），and twenty 20 healthy people were chosen as a control group.The general condition，course of disease，pain visual analogue scale（VAS）scores of all patients were recorded.The renal function，C-reactive protein（CRP）and erythrocyte sedimentation rate（ESR）were checked.The enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）were used to detect the concent-

rations of TLR2，TLR4，MyD88 in peripheral blood，and the software SPSS 22.0 was used to analyze the correlation between TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood and all the indexes.Results：①The concentrations of TLR2，

TLR4 and MyD88 in the peripheral blood of patients with gouty arthritis were significantly higher than those in the healthy control group，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.The concentrations of TLR2，TLR4 and MyD88 in the peripheral blood of the acute group was significantly higher than those in the non-acute group（P < 0.01）.②Comparison among patients respectively with disease course of less than

1 year，1～5 years，5～10 years and over 10 years，TLR2 and TLR4 of those with less than 1 year of disease course were higher，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.There was no statistical significance between patients with the other different disease courses（P > 0.05）.③The VAS score，ESR and CRP in the

acute group were significantly higher than those in the non-acute group，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.The peripheral blood uric acid in the non-acute group was higher than that in the acute group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The differences of urea nitrogen，creatinine and cystatin C in the two groups were not statistically significant（P > 0.05）.④TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood of patients with gouty arthritis were positively correlated with CRP and ESR（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：TLR2，TLR4 and MyD88 are involved in the occurrence and development of gouty arthritis，especially in acute phase.

【Keywords】 gouty arthritis；Toll-like receptor；MyD88；correlation

痛风性关节炎是单钠尿酸盐（MSU）结晶在关节软骨、滑膜及周围组织等沉积而引发非特异性炎症反应，分为急性期和非急性期。MSU结晶是炎症的潜在触发器，除了痛风急性发作炎症反应较重，痛风间歇期、缓解期、慢性痛风和痛风石也普遍存在低水平的无菌性炎症[1]。MSU是一种内源性危险信号相关分子（DAMPs），被机体识别后通过固有免疫引起炎症和细胞凋亡[2]。Toll样受体（TLRs）介导的通路和髓样分化因子88（MyD88）依赖的白细胞介素-1（IL-1）受体途径与MSU结晶引起的急性炎症有关，单核巨噬细胞的细胞膜表面存在Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）可以识别细胞外的MSU晶体，并诱导IL-1β前体的转录，从而产生一系列炎症阶连反应[3]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年12月至2016年10月

在贵阳中医学院第二附属医院风湿免疫科就诊的门诊或住院痛风性关节炎患者120例，所有患者均符合2015年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）制定的痛风分类标准[4]。其中急性痛风性关节炎患者（急性组）76例，非急性痛风性关节炎患者（非急性组）44例；男114例，女6例；年龄21～69岁，平均（48.76±9.20）岁。健康对照组随机抽取贵阳中医学院第二附属医院体检中心健康者20例，性别、年龄比例与痛风性关节炎患者相似。记录患者的具体病程长短，再进行病程分段：< 1年（7例）、1～5年（22例）、5～

10年（35例）、> 10年（56例）。本研究通过贵阳中医学院第二附属医院人体试验伦理委员会审核。所有纳入病例签署知情同意书；排除严重心脑血管疾病、继发性痛风及合并风湿免疫性疾病

患者。

1.2 主要仪器及试剂 三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；-20 ℃冰箱、4 ℃冰箱（中科美菱）；低温高速离心机（美国Thermo Forma公司）；超净工作台（苏洁净化有限公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；电热恒温水域箱（天津泰斯特仪器有限公司）；微量移液枪（德国Eppendorf公司）；全自动生化分析仪（日本TOSHIBA公司）；血沉仪（越华XC-A3A）；全自动血液分析仪（Sysmex XT-2000i）；洗板机（凯特生物医疗电子科技有限公司）；TLR2 ELISA试剂盒、TLR4 ELISA试剂盒、MyD88 ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限

公司）。

1.3 标本收集及检测方法 所有纳入病例均清晨空腹肘部静脉采血，分别用常规抗凝管、生化管采集5 mL静脉血，随即送往贵阳中医学院第二附属医院检验科，使用全自动生化分析仪检测肾功能及全程C-反应蛋白（CRP），血沉仪检测红细胞沉降率（ESR）。将生化管采集的静脉血置于离心机以3000 r·min-1离心10 min，取血清于无菌EP管内，放于-20 ℃冰箱保存，供ELISA检测。临检测时，首先将放于-20 ℃冰箱中保存备用的血清取出，放在室温解冻，同时试验开始前把人TLR2、TLR4、MyD88酶联免疫法吸附测定试剂盒取出在室温中放置30 min，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.4 疼痛视觉模拟评分法（VAS）评分 疼痛

10 cm水平视力对照表[5]：用一条长为10 cm可滑动游标标尺，两端分别为0分和10分。患者指出最能代表疼痛程度的位置，医师记录评分。0级，没有疼痛；1～3级，轻度疼痛，能正常活动；4～

6级，中度疼痛，生活可自理，但影响工作；7～9级，较严重的疼痛，生活不能自理；10级，剧烈疼痛，无法忍受。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以表示，符合正态分布，满足方差齐性，2组间比较采用独立样本t检验，多组间样本资料采用单因素方差分析；不符合正态分布采用非参数（秩和）检验；计数资料以频数和百分比表示，采用χ2检验；相关性分析，数据呈偏态分布采用Spearman分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 痛风性关节炎组与健康对照组TLR2、TLR4、MyD88比较 痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88浓度明显高于健康对照组，2组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 急性组与非急性组TLR2、TLR4、MyD88比较 急性组与非急性组痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88浓度比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 不同病程TLR2、TLR4、MyD88比較 病程 < 1年、1～5年、5～10年、> 10年的患者外周血TLR2、TLR4、MyD88比较，病程< 1年的患者外周血TLR2、TLR4较高，差异有统计学意义

（P < 0.05）；其他各病程段两两比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

2.4 痛风性关节炎与VAS评分、CRP、ESR的关系 数据资料经检验，不符合正态分布，各组间比较采用非参数检验（秩和检验）。患者疼痛VAS评分急性组及非急性组差异有统计学意义

（P < 0.01）。痛风性关节炎急性组患者外周血CRP、ESR明显升高，与非急性组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。见表4。

2.5 痛风性关节炎与肾功能各指标的关系 非急性组患者外周血尿酸高于急性组，2组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；2组尿素氮、肌酐、胱抑素C比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表5。

2.6 TLR2、TLR4、MyD88与临床及实验室指标的相关性分析 各指标经检验后呈偏态分布，采用Spearman检验分析了解其相关性，结果提示，痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88与CRP、ESR呈线性正相关（P < 0.01或P < 0.05）。见表6。

3 讨 论

近年来对痛风急性发作的机理研究显示，TLRs介导的通路和MyD88依赖的IL-1受体途径与MSU结晶引起的急性炎症有关[6]。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白受体，包括胞外区、跨膜区、胞内区，胞外区含有不同长度的亮氨酸重复区域，参与配体的识别；细胞内羧基末端包含一个保守部位，与IL-1受体相似，被称为Toll/IL-1受体结构域（TIR），依赖TIR的嗜同性作用和下游接头蛋白的TIR结合来传导信号[7]。TLRs通过识别相应的配体，然后与这些配体结合，再通过MyD88和干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）依赖性途径（非MyD88依赖性途径）下传信号，激活核转录因子-κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1），启动相关靶基因的转录，快速激活致炎因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素（IFN）、趋化性细胞因子、黏附分子、环氧化酶-2（COX-2）和诱生型一氧化氮合成酶的转录，这些酶的产物和细胞因子在炎症反应中发挥关键作用[8-15]。IL-β是MSU晶体诱导炎症的关键因子，而TLR2和TLR4可以识别细胞外的MSU晶体，诱导IL-β前体的转录[16]。TLRs是决定MSU晶体沉积引起痛风性关节炎的主要因素，TLRs/MyD88信号通路参与了痛风性关节炎的炎症反应过程。因此，TLRs/MyD88信号通路是一个具有多种调节功能的传导通路，在痛风性关节炎的炎症反应过程中起重要作用[17]。国内外众多研究均表明TLR2、TLR4、MyD88与炎症反应密切相关[18-20]。本研究发现，急性组患者疼痛VAS评分、ESR、CRP高于非急性组，提示痛风性关节炎急性期炎症反应重，患者主观感觉疼痛明显。ESR、CRP目前被普遍认为是炎症过程中的急性时相反应物，本研究急性组与非急性组ESR、CRP平均数值均高于基线值，说明不同证型的痛风性关节炎患者均存在不同程度的炎症。非急性组患者外周血尿酸高于急性组，急性组、非急性组中尿素氮、肌酐、胱抑素C没有差异，急性痛风性关节炎患者血尿酸往往不高，尿素氮、肌酐、胱抑素C受病程、病情严重程度等影响，与痛风是否急性发作无相关性。进一步对痛风性关节炎临床、实验室指标与TLR2、TLR4、MyD88进行相关性分析后发现，痛风性关节炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88与ESR、CRP呈正相关，提示痛风性关节炎的发生、发展受TLRs/MyD88信号通路介导，且参与痛风的炎症反应，痛风性关节炎的不同时期均存在炎症，在急性期表现更为

强烈。

本研究结果提示，TLR2、TLR4、MyD88参与了痛风性关节炎患者的发生、发展，尤其在急性关节炎期。总之，痛风性关节炎的发病机制复杂，众多信号通路、细胞因子参与痛风的发病，研究TLRs/MyD88信号通路与痛风性关节炎临床及实验室指标的相关性，进一步阐明了痛风性关节炎的发病机制，以期指导预测病情、评估疗效。目前我们对于TLRs/MyD88信号通路在痛风性关节炎中的研究尚处于初探阶段，下一步将通过不同的方法进一步深入研究。

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收稿日期：2017-10-09；修回日期：2017-12-15