利用组织芯片分析DJ-1蛋白在非霍奇淋巴瘤组织中的定位表达及意义

, ,, , ,,

(1.南华大学医学院肿瘤研究所, 湖南 衡阳 421001; 2.常德职业技术学院; 3.湖南环境生物学院医学院)

非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma, NHL)主要发生在淋巴结、脾脏、胸腺等淋巴器官，它是一类常见的淋巴造血系统恶性肿瘤，占淋巴瘤总发病率的70.1%～95.1%。NHL病情进展较快，且它的发病率和死亡率每年都在稳步增加，严重威胁着人类的健康安全。但迄今为止，人们对NHL的发病机制还没有明确的了解。有研究表明淋巴瘤的发病机制可能与基因突变、免疫抑制、感染、环境等因素有关，其中基因突变引起的原癌基因激活和抑癌基因失活是恶性肿瘤发生发展的关键原因。因此，寻找可作为肿瘤早期诊断和特异性治疗的靶点是NHL治疗的关键。DJ-1蛋白在人体的组织和器官中广泛存在，而DJ-1蛋白缺失或过度表达会引起很多相关疾病，在前列腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中均有发现DJ-1过度表达的情况。研究表明这与肿瘤的发生、侵袭、转移及预后密切相关[1]。然而，关于DJ-1蛋白在NHL中的表达与淋巴瘤生物学特性的关系国内外尚未见文献报道。因此，本文旨在探讨DJ-1蛋白在NHL中的表达及意义，为NHL的诊治提供有价值的实验数据。

1 材料与方法

1.1材料人淋巴瘤组织芯片(LYM1502)，购于上海卓立生物科技有限公司；病理组织学确诊为非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者61例，男31例，女30例，年龄14～80岁，中位年龄42岁；病理组织学确诊为非肿瘤淋巴组织7例作为对照组，包含男3例，女4例，年龄7～52，中位年龄34岁。患者临床、病理及实验室资料完整，病理类型和恶性程度按照WHO(2016)的标准分类。兔抗人DJ-1抗体购自ABGENT公司,SP免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司。

1.2免疫组织化学染色根据超敏SP免疫组化染色试剂盒说明书进行，使用福建迈新生物有限公司提供的已知阳性片作为对照，同时阴性对照组用PBS处理。

1.3组织芯片染色结果判定组织芯片中黄色、棕黄色、棕褐色部位为蛋白阳性表达。每芯随机选取三个不重复的400倍视野，每个视野中随机记数连续的200个细胞，记数每个细胞核与浆中DJ-1蛋白的阳性表达情况，计算阳性表达率。细胞核蛋白表达结果的判定，按细胞核染色强度与细胞核阳性细胞数占细胞总数的百分比综合计分，同理，细胞浆蛋白表达结果的判定，按细胞浆染色强度与细胞浆阳性细胞数占细胞总数的百分比综合计分。根据文献，按染色强度分别计无色者为1分，黄色者为2分，棕褐色者为3分; 按阳性细胞总数分别计总数≤25% 者为1分，26%～50%者为2分，51%～75%为3分，>75%者为4分；将每个组织点染色强度与阳性细胞百分率得分相乘的积为其最后得分。1分为阴性“-”，2～4分为弱阳性“+”，5～8分为中等阳性“++”，9～12分为强阳性“+++”[2]。阴性和弱阳性定义为低表达，中等阳性和强阳性定义为高表达。

1.4统计学分析组织芯片结果数据用SPSS17.0统计软件进行分析，选用用卡方检验和Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DJ-1在NHL和非淋巴瘤组织中的表达情况采用组织芯片结合免疫组化检测DJ-1在NHL及非肿瘤组织中的表达情况，如图1所示。通过镜下计数结果如表1所示：NHL中DJ-1蛋白细胞核高表达率分别为72.1%，显著高于非肿瘤组织(淋巴结反应性增生和正常淋巴结)14.3%(P<0.01)；细胞浆高表达率为93.4%，显著高于非肿瘤组织(淋巴结反应性增生和正常淋巴结)28.6%(P<0.01)。比较NHL中DJ-1在细胞核与细胞浆中的表达情况，NHL中DJ-1的浆表达率为93.4%,明显高于核表达的72.1%。

表1 组织芯片结合免疫组化检测检测DJ-1在非霍奇金淋巴瘤(NHL)及非肿瘤组织中的表达情况

与非肿瘤组织比较，aP<0.01

2.2 DJ-1的表达与NHL恶性程度的关系所示DJ-1在惰性、侵袭性和高度侵袭性淋巴瘤中核高表达率分别为52.2%、82.9%和100%(P<0.05),细胞浆内为82.6%、100%、100%(P<0.05)。DJ-1的表达与恶性程度正相关，且细胞核内DJ-1高表达率较之细胞浆内梯度差异更为明显。见表2。

2.3 NHL中DJ-1的表达与性别、年龄和组织学分型的关系为调查DJ-1的表达是否受性别、年龄和组织学分型的影响，以性别、年龄和组织学来源进行分组统计。其结果如表2所示：DJ-1的表达差异与性别、年龄和组织学分型无显著的相关性(P>0.05)。

图1 DJ-1在非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织及非肿瘤组织中的表达情况(左列100×，右列400×)A:非肿瘤组织，核表达(-)，浆表达(+)； B:非霍奇金淋巴瘤，核表达(+)，浆表达(+++)；C:非霍奇金淋巴瘤，核表达(++)，浆表达(+++)

表2 DJ-1的表达与非霍奇金淋巴瘤恶性程度、性别、年龄和组织学分型的关系

3 讨 论

恶性肿瘤的早期诊断对其治疗具有着重要的意义，恶性肿瘤在早期阶段一般还未具备侵袭转移的能力，如何在其发病早期诊断是目前医学研究的重点。然而，目前人们对恶性肿瘤的形成机制还不是十分了解，能确定的是基因突变引起的癌基因激活且或抑癌基因失活与肿瘤的形成密切相关，因此如何筛选出肿瘤中突变的癌基因或抑癌基因对肿瘤的早期诊断意义非凡。组织芯片又称组织微阵列，能同时检测几十乃至上千的组织标本，具有高通量、误差小、可比性强和准确度高等优点，能帮助筛选恶性肿瘤中具有潜在诊断意义的分子[3]。运用组织芯片筛选出与淋巴瘤发生发展相关的肿瘤生物标记物，对淋巴瘤的诊断、预后评估具有十分重要的意义。

DJ-1蛋白由位于1号染色体短臂远端(1p36.12-1p36.33)区域的同名基因表达，分子大小为20 KDa，并以同源二聚体的形式存在，破坏其二聚体结构往往能使其失活[4]。DJ-1是一种多功能的蛋白质，它能够调节RNA结合蛋白的亚基，氧化还原分子伴侣[5]，半胱氨酸蛋白酶[6]，转录共激活因子[7]等功能。这些功能使DJ-1蛋白牵连着生物过程的各个方面,当然也包括肿瘤的发生和发展。DJ-1蛋白在单独或者与其他癌基因如c-myc、ras等共同作用时能够转化NIH-3T3细胞，暗示了其对基因转录有调控作用并具备致癌潜力。本文实验结果显示NHL细胞核和细胞浆中DJ-1的表达显著高于非肿瘤组织，因此可以认为DJ-1与NHL发生密切相关。

DJ-1作为凋亡过程的一个重要调节点，与肿瘤的形成发展紧密相关。DJ-1调控多条致癌信号通路，在细胞核内能与Daxx结合，阻止其进入细胞质激活ASK1，而ASK1的激活能启动细胞凋亡[8]；DJ-1蛋白在细胞浆中与MEKK1的结合能阻断MEKK1-SEK1-JNK1级联信号通路激活引起的凋亡[9]。由此可见DJ-1参与不同致癌通路的定位是不一样的，或许根据DJ-1在细胞内定位表达的情况结合现有研究资料能初步推测DJ-1参与哪些致癌信号通路。本文实验结果显示NHL细胞中细胞核和细胞浆中都存在高表达的现象，不过细胞浆中DJ-1高表达较细胞核中更为明显。有研究表明DJ-1蛋白结构的C106残基的氧化能阻断 P53的C末端与启动子的结合，从而调控促凋亡因子Bax的转录并抑制下游Caspase酶的活化[10]，而DJ-1的敲低增加了Bax蛋白水平，并加速caspase-3的激活和细胞死亡。这表明DJ-1的细胞保护是通过抑制p53-Bax-Caspase途径来介导的[11]。DJ-1对p53的这种抑制活性取决于本身的sumo化，它是泛素化修饰的一种，且主要在翻译后参与蛋白质的修饰，能使蛋白质构象更加稳定并调节蛋白质的核运输、信号传递等[12]，当Sumo化位点发生突变时，DJ-1将无法向核内转移并丧失其通过p53-Bax-Caspase通路诱导细胞凋亡的能力[13]。这种核内转移的现象或许是本文实验结果中细胞核和细胞浆中都存在高表达现象，但却有强弱之别的原因。

尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)能使肿瘤周围的基质蛋白降解并促进肿瘤的转移和侵袭[14]，而侵袭和转移对评估肿瘤的恶性程度及判断患者预后具有重要意义。DJ-1蛋白能使ERK和SRC磷酸化继而激活下游的ERK/ uPA通路，因此DJ-1的高表达能促进恶性肿瘤的转移侵袭。另外多种肿瘤患者体内呈现血清DJ-1蛋白的高水平，而这往往与肿瘤的转移密切[15]。DJ-1可能作为肿瘤转移早期诊断和监测的潜在生物标志物有着巨大的潜力。在本实验结果中，DJ-1的高表达率与NHL的恶性程度正相关，即恶性程度高的淋巴瘤中DJ-1的表达更高，故DJ-1可能与NHL的转移和侵袭等恶性进程密切相关。实验结果中DJ-1于肿瘤细胞中核、浆内都有高表达，浆表达更加明显但核表达却能根据NHL的恶性程度表现出差异梯度，似乎作为诊断标准更为合适。但在DJ-1临床应用前仍需扩大实验标本量并进一步明确该蛋白在NHL中的表达强度与转移和侵袭的关系。DJ-1作为肿瘤恶性行为的分子诊断指标以及评估患者预后都具有极大潜力和重要意义。

不止于在诊断方面探索，DJ-1在肿瘤的治疗方面也有许多研究进展。研究表明DJ-1的沉默能增加肿瘤对药物的敏感性，使用RNA干扰技术(siRNA)沉默DJ-1基因能使肿瘤细胞生长能力受损并增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性如吉西他滨、顺铂等。这提示DJ-1的高表达与肿瘤耐药性密切相关，而通过检测耐药肿瘤中DJ-1表达情况，使用靶向干扰DJ-1的药物来抑制DJ-1的表达也许能改善化疗药物的疗效，增加化疗成功率。因此化疗药物与靶向干扰DJ-1药物的联合治疗方法是极具潜力的新型抗肿瘤手段。

参考文献：

[1] 王娟, 谭晖, 苏琦. DJ-1在肿瘤中作用的研究进展[J]. 临床与病理杂志, 2011, 31(6):527-30.

[2] 刘殊, 王士勇, 张晖, 等. NIBP在结肠癌组织中的表达及临床意义[J]. 现代肿瘤医学, 2015,23(7):974-7.

[3] 付实, 张琍. 组织芯片技术在消化道肿瘤研究中的应用[J]. 中南医学科学杂志, 2017,45(2):183-5.

[4] GöRNER K, HOLTORF E, WAAK J, et al. Structural determinants of the C-terminal helix-kink-helix motif essential for protein stability and survival promoting activity of DJ-1[J]. J Biol Chem， 2007， 282(18): 13680-91.

[5] CULLETON BA, LALL P, KINSELLA GK, et al. A role for the Parkinson’s disease protein DJ-1 as a chaperone and antioxidant in the anhydrobiotic nematode Panagrolaimus superbus[J]. Cell Stress Chaperones, 2015, 20(1):121-37.

[6] KISS R, ZHU M, JóJóRT B, et al. Structural features of human DJ-1 in distinct Cys106 oxidative states and their relevance to its loss of function in disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2017,1861(11 Pt A):2619-29.

[7] ISHIKAWA S, TAIRA T, TAKAHASHI-NIKI K, et al. Human DJ-1-specific transcriptional activation of tyrosine hydroxylase gene[J]. J Biol Chem, 2010, 68(51):39718-31.

[8] JUNN E, TANIGUCHI H, JEONG B S, et al. Interaction of DJ-1 with Daxx inhibits apoptosis signal-regulating kinase 1 activity and cell death[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(27):9691-96.

[9] MO J S, KIM M Y, ANN E J, et al. DJ-1 modulates UV-induced oxidative stress signaling through the suppression of MEKK1 and cell death[J]. Cell Death Differ, 2008, 15(6):1030-41.

[10] KATO I, MAITA H, TAKAHASHI-NIKI K, et al. Oxidized DJ-1 inhibits p53 by sequestering p53 from promoters in a DNA-binding affinity-dependent manner[J]. Mol Cell Biol, 2013, 33(2):340-59.

[11] SHINBO Y, TAIRA T, NIKI T, et al. DJ-1 restores p53 transcription activity inhibited by Topors/p53BP3.[J]. Int J Oncol, 2005, 26(3):641-48.

[12] PTAK C, WOZNIAK RW. SUMO and Nucleocytoplasmic Transport[J]. Adv Exp Med Biol, 2017,963:111-26.

[13] FAN J, REN H, FEI E, et al. Sumoylation is critical for DJ-1 to repress p53 transcriptional activity[J]. FEBS Lett， 2008， 582(7): 1151-56.

[14] HE X, ZHENG Z, LI J, et al. DJ-1 promotes invasion and metastasis of pancreatic cancer cells by activating SRC/ERK/uPA[J]. Carcinogenesis， 2012， 33(3): 555-62.

[15] Han B, Wang J, Gao J, et al. DJ-1 as a potential biomarker for the early diagnosis in lung cancer patients[J]. Tumour Biol,2017,39(6):1-7.