泌尿生殖道支原体固体培养基的研制及临床应用

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(江门市皮肤医院，广东 江门 529000)

支原体是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过滤菌器、在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物[1]。目前引起人类泌尿生殖道感染的主要有解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)、人型支原体(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原体(M. genitalium, Mg)与穿透支原体(M. penetrans, Mpe)[2-4]。随着支原体引起的泌尿生殖道感染的发病率增高，亟待研制一种快速、准确的支原体培养基与培养方法。目前，国内对泌尿生殖道支原体的临床检测多数采用液体培养法，这一方法已延用20多年，但临床实践中已暴露出诸多缺点。支原体在固体培养基上形成的特征性菌落是泌尿生殖道感染的直接证据，没有假阳性存在，是一种较科学的检测手段。为此，本文旨在研制一种适合临床检测泌尿生殖道支原体的固体培养基和培养方法并进行初步的临床应用。

1 材料与方法

1.1标准菌株Uu标准株(ATCC27813)和Mh标准株(ATCC15488)由南华大学病原生物学研究所惠赠。

1.2支原体培养基的配制

1.2.1 自制支原体培养基 在基础肉汤上增加1%的蛋白胨，并用25%新鲜酵母配制，用1 mol/L NaOH调pH至6.5，8磅高压灭菌30 min，待冷却后加入终浓度分别为20%小牛血清、0.1%尿素、0.1%精氨酸，0.002%酚红、100 μg/mL万古霉素、3 μg/mL两性霉素及50 μg/mL多粘菌素B等，分装试剂盒，每支1.5 mL。在此基础上，在无菌条件下加入0.9%的琼脂，并倾注5 cm平皿即固体培养基。4～8 ℃保存备用。

1.2.2 对照培养基 选用IST2支原体分离、鉴定、药敏试剂盒(法国梅里埃公司批号：1005926020)和A7支原体固体培养基(法国梅里埃公司批号：1005665600)。

1.3检测对象收集本院性病科门诊2017年1月～6月的检测标本，共594例，其中男性415例，女性179例。年龄19～57岁，平均31.7±5.7岁。所有患者均有尿道炎症状或宫颈炎症状。其中男性主要表现为尿频、尿急、尿道口稀薄分泌物、腹部下坠痛等症状；女性主要表现为阴道分泌物异常(增多、颜色发黄、有异味、脓性或血性等)、外阴瘙痒、下腹痛等症状。

1.4检测方法接种：常规用无菌棉拭取材，男性患者取尿道拭子，女性患者取宫颈拭子。取材后立即接种于自制支原体双相液体培养基与梅里埃IST2肉汤中，分别取60 μL分3滴滴加于自制的固体培养基与A7支原体固体培养基表面[5]，置37 ℃恒温培养箱中放置10～20 min，待液面干后将培养皿倒置放于37 ℃的CO2培养箱中进行培养，并分别于16 h、20 h、24 h、36 h、48 h时间段观察两种液体培养基颜色变化单位(color changing unit，CCU)，同时用显微镜于低倍镜下观察两种固体培养基的菌落形成单位(colony forming unit，CFU)并观察支原体菌落形态。大于48 h液体培养基澄清不变色且固体培养基上无支原体菌落生长者视为阴性，并记录结果。

1.5统计学方法采用SPSS 18.0软件进行数据处理，一致性检验采用κ值表示：极好的一致性(0.81<κ<1.0)，高度一致性(0.61<κ<0.8)，中度一致性(0.41<κ<0.6)，一致性差(0.81<κ<1.0)，无意义(κ<0)。率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1标准株检测结果标准株在梅里埃IST2肉汤、A7固体培养基和自制支原体双相液体、固体培养基中均能生长。梅里埃IST2肉汤CCU为20 h，而自制支原体双相液体培养基CCU小于16 h；梅里埃A7固体培养基CFU(≥104)为24 h，自制支原体固体培养基CFU(≥104)小于16 h。

2.2自制液体和固体培养基有较高的质量标本接种16 h时，自制支原体液体和固体培养基与对照组梅里埃试剂IST2和A7培养基的阳性率分别为8.92%(53/594)和3.70%(22/594)，20 h培养的阳性率分别为21.38%(127/594)和13.30%(79/594)，自制支原体培养基在16 h和20 h的阳性检出率均明显优于对照组梅里埃试剂(χ2=13.68，P<0.01；χ2=13.53，P<0.01)。自制固体培养基上长出的菌落有92.27%于16 h～24 h之间可辨认。48 h培养后，594例临床标本中梅里埃IST2和自制双相液体培养基混浊生长分别有7例和14例，这两种液体培养基的抑菌率分别为98.82%(587/594)和97.64%(580/594)，抑菌效果基本一致。

2.3自制固体培养基与A7培养基有较好的一致性以镜下固体培养基上的典型支原体菌落形态作为阳性判断标准(图1)，梅里埃A7培养基培养阳性192例，自制支原体固体培养基阳性194例，结果见表1。以梅里埃A7培养基作为“金标准”，如表2所示：自制支原体固体培养基的敏感性为97.92%(188/192)，特异性为98.51%(396/402)，经卡方检验，两者差异无显著性(χ2=0.10，P>0.05)，κ值为0.96，即自制固体培养基与A7培养基有较好的一致性。

表1 梅里埃与自制培养基鉴定594例临床标本中支原体效果比较

a：培养时间大于48 h且培养基混浊变红色；b：培养时间大于48 h且培养基混浊不变色；c：培养时间大于48 h培养基澄清不变色

表2 梅里埃A7与自制固体培养基的培养结果比较

图1 支原体在自制支原体固体培养基上的菌落形态(10×)A：Uu，呈棕黑色海胆样菌落；B：Mh，呈无色油煎蛋样菌落；C：Uu与Mh混合生长

3 讨 论

解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)是泌尿生殖道感染较为常见的病原体，对于这两种支原体的检测，常规采用Uu和Mh单相液体培养基，经培养后通过观察液体CCU来诊断，但是单相液体培养基的CCU无法真正将Uu和Mh从送检标本中分离出来，液体培养基主要通过添加不同底物使其发生生化反应对其作出间接判断，若送检标本的杂菌多，使抑菌剂无效，从而容易造成培养污染、假阴性或假阳性等结果。所以，根据国内外学者的普遍意见，固体培养是判断标本中有无支原体存在的金标准方法，固体培养具有液体培养无可替代的优势：其一是根据典型菌落形态可以作出直接判断，不会出现假阳性结果，即使固体培养基有轻度污染也不会影响支原体生长及观察；其二是根据菌落形态和出现时间可以在固体培养基上同时鉴别多种支原体，并能进行纯培养，用于后续研究[6]。目前，国内医院检验科常用市售的液体双相培养基进行分离和鉴定支原体，同时附以药敏板联合培养，以便更快地帮助患者明确诊断和尽早应用敏感的抗生素治疗[7]。支原体在液体中生长，Uu分解尿素，Mh分解精氨酸，均使液体培养基颜色由黄变红，进而鉴别支原体。由于泌尿生殖道内含有多种微生物，有些微生物同样可分解尿素或精氨酸，从而使培养基颜色变红并出现浑浊或沉淀，若仅依据颜色改变可增加假阳性或假阴性率。另外，液体培养只是一种生化鉴定，无法准确判断有无支原体生长，且同一种液体培养基通常无法同时判断两种以上支原体生长，所以进行支原体固体培养基研制和应用具有临床诊断意义。

鉴于国内临床实践中出现的问题及微生物学对诊断的要求，为此，本文旨在研究一种适合临床检验用的固体培养基和培养方法。支原体双相培养基要提高支原体阳性检出率，必须注重微生物的生态环境，如培养基的营养成分、pH值、抑菌剂及指示剂的选择等。本文借鉴公认的A7配方[8-9]，增加了蛋白胨、小牛血清含量，同时添加了DMEM，并用25%新鲜酵母配制。将传统培养基中的抑菌剂青霉素改为万古霉素、两性霉素及多粘菌素B，能有效地抑制革兰阳性细菌、革兰阴性细菌及真菌生长，防止杂菌污染。由于支原体属于无细胞壁微生物，所以临床通常选用β-内酰胺类抗生素(如青霉素)来抑制具有细胞壁的杂菌，但是青霉素在水溶液中不稳定，抗菌谱狭窄，耐药菌株多，在低浓度的水溶液中易分解，加之泌尿生殖道杂菌多，特别是耐药的葡萄球菌大量存在，致使培养基污染长菌，抑制了支原体的生长。

本研究从表1数据可知，16 h内生长且镜下可见典型菌落的梅里埃A7培养基有22株，而自制固体培养基有53株；20 h内生长且镜下可见典型菌落的梅里埃A7培养基有79株，而自制固体培养基有127株，支原体在自制培养基中16 h和20 h的生长速度明显优于梅里埃培养基(χ2=13.68，P<0.01；χ2=13.53，P<0.01)。经48 h培养后，培养基混浊提示有细菌生长，梅里埃IST2有7例，自制双相液体培养基有14例，自制双相液体培养基抑菌效果达97.64%。若以镜下的典型支原体菌落形态作为阳

性判断标准，梅里埃A7培养基培养阳性有192例，自制支原体固体培养基阳性194例。以梅里埃A7培养基作为“金标准”，自制支原体固体培养基的敏感性为97.92%，特异性为98.51%，两者差异无显著性(χ2=0.10，P>0.05)，说明自制的支原体固体培养基分离Uu和Mh的效果显著，Uu和Mh在这种培养基上均能够生长良好，为一种培养基上同时分离Uu和Mh两种支原体提供了良好技术支持，较液体培养更具有科学性临床意义和应用价值。

总之，本研究生产的液体和固体培养基有其自身特点，将自制的支原体固体培养基用于Uu和Mh分离，可获得与生物梅里埃A7固体培养基和IST2同样的效果，支原体菌落生长速度快，且来源方便、价格低廉，适合基层单位开展支原体检测和诊断。

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