枇杷醋生产中酒精发酵工艺优化及酸味特征分析

段珍珍DUAN Zhen-zhen 周才琼,2 -,2 袁 敏 常 荣

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715)

枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl]为蔷薇科(Rosaceae)苹果亚科枇杷属(EriobotryaLindl.)植物，果肉富含苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸及草酰乙酸等[1]，含不同种类的胡萝卜素、三萜类和多酚类等成分[2]。枇杷含水量高，不耐贮藏，鲜果货架期短，因此其深加工备受关注。枇杷深加工主要集中在枇杷饮料[3-4]和枇杷果酒[5-6]的研发。

果醋主要以水果或果品加工下脚料为原料，经酒精发酵和醋酸发酵酿制而成。果醋有很多种类，有用于烹饪调味，也有用于饮用保健，其中应用于烹饪的酸度最高达5%，饮料果醋的酸度较低(为1%)[7]。现有报道集中于果醋的工艺研究，大多在酿造出果醋原醋基础上，调配大量果汁、蜂蜜、添加剂等兑制而成酸甜可口的果醋饮品[8-9]。有少量报道了研制有明确用途的果醋，如调味型苹果醋、葡萄醋[10-11]和保健型沙棘果醋[12]。果醋进一步的研究包括雪利醋功能作用[13]、柿果醋发酵过程中香气成分和有机酸的动态变化[14]及果醋陈化后熟等[15]。这些研究极少涉及果醋醋酸发酵最重要的基础——醋基的研究，枇杷果醋更少见报道。作为后续醋酸发酵的醋基，其有机酸含量及组成极大程度影响果醋的风味品质。因此酒精发酵工艺的选择是优良品质的保证，作为醋基的枇杷酒中的有机酸主要来自枇杷果实、工艺需求的外源添加酸和酒精发酵过程中酵母代谢产物，是枇杷醋风味品质构成基础。为此，本研究采用红肉枇杷为试验材料，以有机酸组成和含量、枇杷醋酒精发酵相关特征为依据，研究酵母种类及接种量、发酵pH、发酵温度和加糖量等对枇杷醋醋基酒精含量和有机酸的影响，通过单因素和响应面试验探究枇杷醋醋基的最佳酿造工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

红肉枇杷：金华1号，西南大学农业综合开发研究室科研基地；

白砂糖：重庆市北碚区天生街永辉超市；

安琪酿酒干酵母：分别为Ya、Yb和Yc，安琪酵母股份有限公司；

帝伯仕酿酒干酵母：Yd，烟台帝伯仕自酿机有限公司。

1.1.2 主要试剂

果胶酶：酶活力≥50万 U/g，成都科龙化工试剂厂；

柠檬酸、柠檬酸钾、邻苯二甲酸氢钾等：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

磷酸二氢钾：优级纯，成都科龙化工试剂厂；

异抗坏血酸：纯度99%，瑞士阿达玛斯试剂；

甲醇：色谱纯，天津四友精细化学品有限公司；

柠檬酸标准品(纯度≥97.0%)、草酸标准品(纯度≥99.5%)：中国食品药品检定研究院；

L-苹果酸标准品、L-酒石酸标准品：纯度HPLC ≥98%，上海源叶生物科技有限公司；

琥珀酸标准品(纯度≥99.5%)、乳酸标准品(纯度≥91.2%)：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

乙酸标准品：纯度≥99.8%，美国Sigma-aldrich公司。

1.2 主要设备

pH计：PHS-3C型，上海仪电科学仪器股份有限公司；

折射仪：WZS手持式，上海仪电物理光学仪器有限公司；

电热恒温培养箱：HH.B11.500-BS-II型，上海跃进医疗器械厂；

恒温培养振荡器：ZWY-2102C型，上海智诚分析仪器制造有限公司；

电子天平：FA2004A型，上海精天电子仪器有限公司；

高效液相色谱仪：LC-2010AD型，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵基本工艺过程及操作要点

(1) 护色：成熟枇杷果实洗净、去核及果蒂，0.05%亚硫酸氢钠溶液在(25±3) ℃浸泡30 min护色，沥水备用。

(2) 打浆：护色后枇杷果加入0.05%亚硫酸氢钠和0.01% 异抗坏血酸进行打浆。

(3) 酶解：将枇杷果打浆后加入果胶酶0.18 g/kg，调pH至3.5， 于35 ℃酶解8 h(出汁率90%)，85 ℃灭菌15 min，用保鲜膜将灭菌后的枇杷果汁封口并迅速冷却至室温，得枇杷果汁(可溶性固形物8.2%，总酸0.3%)。

(4) 酵母活化及筛选：用5%的糖水溶解酵母，38 ℃水浴活化，30 min后有细腻泡沫出现为活化成功。然后选用1.1.1 所列4种酵母分别接种，控制糖度在20%，pH 3.5，25 ℃ 恒温发酵7 d后，测定各指标，选择适合枇杷醋酒精发酵(醋基)的菌种。

(5) 发酵：调整枇杷果汁pH和初始糖度，将酵母活化后接种，在一定温度下发酵7 d检测分析。

1.3.2 枇杷醋酒精发酵工艺单因素试验

(1) 发酵pH对枇杷醋酒精发酵的影响：固定反应条件为枇杷果汁糖度20%、酵母接种量0.10%、发酵温度25 ℃、发酵时间7 d，考察发酵pH(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0)对枇杷醋酒精发酵的影响。

(2) 酵母菌接种量对枇杷醋酒精发酵的影响：固定反应条件为枇杷果汁糖度20%、发酵pH 3.5、发酵温度25 ℃、发酵时间7 d，考察酵母接种量(0.05%，0.1.0%，0.40%，0.70%，1.00%)对枇杷醋酒精发酵的影响。

(3) 发酵温度对枇杷醋酒精发酵的影响：固定反应条件为枇杷果汁糖度20%、发酵pH 3.5、酵母接种量0.10%、发酵时间7 d，考察发酵温度(20，24，28，32 ℃)对枇杷醋酒精发酵的影响。

(4) 初始糖度对枇杷醋酒精发酵的影响：固定反应条件为发酵pH 3.5、酵母接种量0.10%、发酵温度25 ℃、发酵时间7 d，考察初始糖度(12%，16%，20%，24%)对枇杷醋酒精发酵的影响。

1.3.3 响应面法优化枇杷醋醋基发酵条件 在单因素试验基础上，固定初始糖度16%，研究发酵温度、酵母接种量和初始pH对枇杷醋醋基发酵的影响，以发酵酒精度和总有机酸含量为响应值，采用Box-Behnken响应面设计，优化发酵最佳工艺。

1.3.4 有机酸组成分析 根据文献[16]，修改如下：

(1) 标准溶液制备：准确配制各有机酸标准母液，分别称取苹果酸标准品91.7×10-3g，酒石酸标准品63.6×10-3g，草酸标准品105.7×10-3g，柠檬酸标准品130.2×10-3g，乳酸标准品99.8×10-3g，乙酸标准品0.5 mL，分别定容至5 mL，称取琥珀酸标准品257.3×10-3g，定容至10 mL。根据样品中有机酸含量将有机酸标准母液稀释成不同浓度混合有机酸标准工作液，用0.45 μm水相滤膜过滤后进样，确定各有机酸出峰时间。将稀释成不同浓度的混合有机酸标准工作液进样分析，有机酸标准曲线横坐标为浓度，纵坐标为峰面积，进行线性回归分析。

(2) 样品溶液制备：取样品于4 000 r/min离心10 min，取上清液稀释5倍，用0.45 μm水相滤膜过滤，进样分析，计算各有机酸含量。

(3) HPLC分析：Hypersil ODS(C18)色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温28 ℃；检测波长210 nm；流速0.6 mL/min；进样量15 μL；流动相为99%的用磷酸调节pH为 2.50的0.06 mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和1%的甲醇溶液。

1.3.5 其他指标

(1) 酒精度：按GB/T 15038—2006的酒精计法执行。

(2) 可溶性固形物(TSS)：按GB/T 15038—2006的糖度计直接测定执行。

(3) pH：按GB/T 15038—2006的pH计法执行。

(4) 失重：按式(1)计算。

m=m1-m2，

(1)

式中：

m——失重，g；

m1——开始发酵时发酵液及发酵装置的总重量，g；

m2——发酵结束后发酵液及发酵装置的总重量，g。

1.3.6 数据处理 试验平行3次，结果以平均数±标准偏差表示；采用SPSS 22.0和Excel进行数据处理与统计分析，Duncan法做多重比较，分析数据间的差异；用Design-expert 8.0.6设计响应面试验方案及数据分析。

2 结果与分析

2.1 枇杷鲜果有机酸组成分析

酶解前枇杷果浆有机酸含量组成分析见表1，显示其主要由苹果酸组成，占总有机酸含量的83.81%，与文献[17]报道苹果酸是枇杷主要的有机酸相符，其次是琥珀酸和酒石酸，有少量乙酸、柠檬酸和草酸。

2.2 枇杷醋酒精发酵酵母的筛选

由表2可知，各处理样品酒精度、TSS及pH值比较接近，各酵母发酵后酒精度在11.4%～12.2%Vol，均远高于后续醋酸发酵时所需酒精量，但采用高糖发酵可更好地观察酵母菌对糖的利用情况，有一定参考价值。有机酸组成分析见表3，与枇杷鲜果有机酸组成含量相比(表1)，苹果酸快速下降，含量仅为鲜果的47.4%～53.2%，其他各处理有机酸含量急剧上升，乳酸和乙酸占比较高，表明酵母发酵显著改变了有机酸组成及酸味特点。试验各组苹果酸、乳酸、酒石酸和草酸有显著差异(P<0.05)。乳酸、乙酸、苹果酸和柠檬酸分别占总有机酸含量的24.96%～29.33%，22.89%～25.05%，15.14%～16.51%，12.15%～14.02%，乳酸和乙酸占比较高，Yb和Yd总有机酸含量显著高于Ya和Yc，Yb中乙酸、柠檬酸和琥珀酸含量最高，Yd中乳酸、苹果酸和酒石酸最高，但Yb酸味感更柔和圆润。综合考虑，选用Yb作为枇杷醋酒精发酵最优发酵菌种。

表1 枇杷鲜果有机酸组成分析Table 1 Analysis of organic acid composition of fresh loquat

表2 不同酿酒酵母对发酵的影响Table 2 Effects of different yeast with fermentation

表3不同酵母接种发酵对有机酸含量的影响†

Table 3 Effects of different yeast on organic acids content g/L

酵母草酸酒石酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸合计 Ya0.275±0.007ab0.863±0.023bc2.606±0.057b4.526±0.524ab3.781±1.151a2.181±1.001a1.929±0.286a16.160±0.702b Yb0.280±0.008a0.909±0.025ab2.763±0.021ab4.555±0.100ab4.571±2.013a2.559±0.974a2.612±0.409a18.249±1.389a Yc0.261±0.009b0.844±0.022c2.634±0.082b4.071±0.574b3.875±1.052a1.965±0.680a2.309±0.797a15.961±0.726b Yd0.287±0.013a0.952±0.035a2.929±0.205a5.440±0.537a4.245±1.624a2.253±0.895a2.439±0.499a18.544±1.326a

† 同列不同小写字母表示不同发酵菌种的均值差异显著(P<0.05)。

2.3 枇杷醋酒精发酵单因素试验

2.3.1 温度对枇杷醋酒精发酵的影响 由表4可知，24，28 ℃ 下发酵时酒精度较高，失重较多，发酵较完全；发酵后的残糖随温度上升而增加。有机酸组成分析见表5，与枇杷鲜果有机酸组成(表1)相比，苹果酸略有下降，其他各有机酸均不同程度增加。低温发酵利于柠檬酸积累，高温发酵利于乳酸积累(P<0.05)。柠檬酸有愉快清新的酸感，酸味爽快，后苦时间短[18]。苹果酸保持稳定，与Kandylis等[19]报道温度会影响苹果酸的分解不符，可能与枇杷果汁中苹果酸的存在形式有关。感官品评显示在较低温度下发酵的枇杷醋醋基酸味感更均衡柔和，综合考虑选取24 ℃为最适发酵温度。

表4 发酵温度对发酵的影响Table 4 Effects of different fermentation temperatures with fermentation

表5 发酵温度对有机酸含量的影响†Table 5 Effects of different fermentation temperatures with organic acids contents g/L

† 同列不同小写字母表示不同发酵温度的均值差异显著(P<0.05)。

2.3.2 酵母接种量对枇杷醋酒精发酵的影响 由表6可知，随酵母接种量的增加酒精度呈先增后降趋势。0.05%和0.10% 处理酒精度和失重相对较高，且0.10%发酵残糖比0.05% 低。有机酸组成分析见表7，与枇杷鲜果有机酸组成(表1)相比，苹果酸下降，乳酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸均增加较多。试验各处理总酸含量没有差异，较低接种量有利于乳酸和苹果酸积累(P<0.05)。综合考虑以0.10%为最适酵母接种量。

2.3.3 初始pH对枇杷醋酒精发酵的影响 由表8可知，随pH升高酒精度先升后降，pH 3.5时，酒精度最高且残糖最低。有机酸组成分析见表9，与枇杷鲜果有机酸组成(表1)相比，苹果酸有所下降，乙酸和乳酸增加较多。随发酵pH升高，苹果酸和乳酸显著增加(P<0.05)。乳酸是酒精发酵产物，由丙酮酸还原或苹果酸转化而成，有报道[20]果汁pH在4.0～6.0时可提高乳酸含量。pH 3.5时柠檬酸最低，这与pH调节有关，其他处理均添加了外源柠檬酸或柠檬酸钾。pH 3.5处理酸味感更均衡柔和，为最适发酵pH值。

表6 酵母接种量对发酵的影响Table 6 Effects of different yeast inoculation with fermentation

表7 酵母接种量对有机酸含量的影响†Table 7 Effects of different yeast inoculation with organic acids contents g/L

† 同列不同小写字母表示不同发酵菌种的均值差异显著(P<0.05)。

表8 初始pH对发酵的影响Table 8 Effects of different pH with fermentation

表9 发酵pH对有机酸含量的影响†Table 9 Effects of different pH with organic acids contents g/L

† 同列不同小写字母表示不同发酵pH的均值差异显著(P<0.05)。

2.3.4 初始糖度对枇杷醋酒精发酵的影响 由表10可知，随初始糖度升高，酒精度、失重和残糖量增高。有机酸分析见表11，与枇杷鲜果有机酸组成(表1)相比，苹果酸快速下降，柠檬酸增加较多，其他有机酸均不同程度增加。乳酸和乙酸含量随初始糖度升高显著增加(P<0.05)。糖度越高，苹果酸含量越低，乳酸含量越高，推测苹果酸转化成了乳酸，同时参与了苹果酸-酒精发酵，酿酒酵母能分解10%～30%的苹果酸来生成酒精[21]，从而造成苹果酸的消耗。随初始糖度升高，总有机酸含量升高。但糖度是影响酒精度最重要的因素，考虑后续醋酸发酵中醋酸耐酒精度在8%Vol左右，因此选择16%的糖度作为枇杷醋酒精发酵糖度。

表10 初始糖度对发酵的影响Table 10 Effects of different initial sugar with fermentation

表11 初始糖度对有机酸含量的影响†Table 11 Effects of different initial sugar with organic acids contents g/L

† 同列不同小写字母表示不同发酵初始糖度的均值差异显著(P<0.05)。

2.4 响应面优化枇杷醋醋基发酵工艺

2.4.1 试验设计及结果 根据单因素试验结果设计了响应面优化因素和水平，见表12。以发酵后枇杷醋醋基酒精度和总有机酸含量为响应值，结果见表13。

表12 响应面优化试验因素水平表Table 12 Factors and levels of response surface optimization test

表13 响应面优化试验设计及结果Table 13 The design and results of response surface optimization test

2.4.2 以酒精度为响应值分析结果 对表13酒精度进行二次线性回归拟合，得回归方程：

Y1=7.96+0.025A-0.12B-0.13C+0.075AB-0.13AC+0.17BC-0.14A2+0.057B2+0.16C2。

(2)

2.4.3 以有机酸含量为响应值的分析 对表13有机酸含量进行二次线性回归拟合，得回归方程为：

Y2=18.04-0.068A-0.51B+3.11C+6.775E-003AB-0.45AC-2.25BC-2.01A2-0.20B2+0.38C2。

(3)

表14 酒精度回归模型方差分析†Table 14 Analysis of variance of alcohol regression model

表15 有机酸回归模型方差分析†Table 15 Analysis of variance of organic acid regression model

2.5 枇杷醋酒精发酵最佳工艺优化及验证

响应面优化结果显示酒精含量的影响顺序是接种量=pH>温度，有机酸含量的影响顺序是pH>接种量>温度；考虑较高的酒精含量是后续醋酸发酵制备枇杷醋的基础，有机酸含量主要受pH的影响，以及在单因素试验中已经综合考虑了有机酸组成。因此，最终以酒精含量为依据，采用Design-expert 8.0.6对枇杷醋酒精发酵工艺进行优化，得到优化条件：发酵温度25.06 ℃，酵母接种量0.05%，初始pH 3.5，模型预测的酒精度为8.61%Vol，总有机酸含量为13.319 g/L。根据实际条件，将发酵温度设为25 ℃，其他条件同优化结果，经3次平行验证实验，实际测得酒精度平均为8.50%Vol，与预测值相对误差1.28%，总有机酸含量平均为12.228 g/L，与预测值相对误差8.19%。说明该数学回归模型可靠，能很好地预测试验结果。

经与酶解后枇杷果汁有机酸组成进行比较分析，结果见表16，枇杷果汁主要酸味特征成分是苹果酸，占总味觉强度的73.0%，经酒精发酵后有机酸含量及组成发生了巨大变化，苹果酸占总味觉强度比为33.1%，柠檬酸和草酸含量下降，合计味觉强度从枇杷果汁的13.3降至4.6；乳酸、乙酸和琥珀酸均增加，合计味觉强度从枇杷果汁的59.4升至377.0；酒石酸略有下降。这可能与有机酸在发酵过程中参与TCA循环、乙醛酸循环、苹果酸-乳酸、苹果酸-乙醇和苹果酸-琥珀酸等代谢反应有关[22-23]。

表16枇杷醋醋基中有机酸形成及味觉强度†

Table 16 The content of organic acids and its taste intensity index with base wine of loquat vinegar

有机酸枇杷果汁(酶解后)含量/(g·L-1)味觉强度枇杷醋醋基含量/(g·L-1)味觉强度苹果酸8.181±0.037303.05.460±0.119202.2 乳酸 0.408±0.18422.73.186±0.242177.0 乙酸 0.312±0.04926.01.774±0.075147.9 琥珀酸0.257±0.06410.71.250±0.23452.1 酒石酸0.588±0.00139.20.417±0.01627.8 柠檬酸0.201±0.01010.60.075±0.0114.0 草酸 0.310±0.0092.70.065±0.0040.6 合计 10.257±0.129414.912.228±0.421611.6

† 味觉强度=有机酸浓度/有机酸味觉阈值[24-25]。

枇杷果汁和酒精发酵后的醋基苹果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸合计占总酸比分别为89.3%和95.4%，味觉强度合计占比分别为87.5%和94.7%，是枇杷醋醋基的重要酸味成分。苹果酸味爽快稍苦，乳酸稍有涩感而尖利，醋酸带刺激性，琥珀酸味感既苦又咸并带一丝鲜味，可使滋味浓厚，加上柠檬酸等共同构成了枇杷醋醋基酸味特征，为后续醋酸发酵后的枇杷醋成品酸味感提供基础。

3 结论

枇杷醋酒精发酵优化工艺条件为：发酵温度25 ℃、酵母接种量0.05%、pH 3.5，在此条件下得到枇杷醋醋基酒精度8.50%Vol，有机酸含量12.228 g/L。经对枇杷果汁和枇杷醋醋基有机酸组成及含量变化进行比较显示，苹果酸是枇杷果汁主要的有机酸。枇杷醋醋基特征性有机酸为苹果酸、乳酸、乙酸和琥珀酸，合计占总有机酸的95.4%，构成枇杷醋醋基酸味味觉强度的94.7%，它们是后续醋酸发酵后构成枇杷醋果酸味的重要品质成分。

有关果醋酒精发酵工艺优化中的有机酸及菌种筛选方面未见相关报道，因此对于果醋的酒精发酵工艺有关菌种筛选条件、醋基风味品质与最终果醋风味形成等还需要更多的研究支持。

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