黑茶茶褐素与茶多糖对脂肪酶的抑制作用

李祥龙 Xiang-long 李晓梅 - 杨 煦 唐 磊 许靖逸,2,3 -,2,3

(1. 四川农业大学园艺学院, 四川 成都 611830；2. 四川省茶业科学与工程重点实验室, 四川 成都 611830；3. 四川省藏茶茶业工程技术研究中心, 四川 雅安 625014)

脂肪酶，又称甘油酯水解酶，是水解脂肪的一类酶的总称，隶属于羧基酯水解酶类[1]。Chiesi等[2-3]的研究表明，脂肪酶与肥胖关系密切，利用脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中脂肪酶的活性，减少进入体内的脂肪代谢，影响体内脂肪的积累和合成，从而达到减肥的目的。

黑茶(Black Tea)属于后发酵茶，是六大茶类中唯一一类有微生物参与其加工过程及品质形成的特殊茶类，主产于湖南、湖北、云南、四川、广西等省(区)。黑茶是六大茶类中加工鲜叶原料最粗老的茶类，多采用四叶五叶、甚至修剪枝叶，其茶叶多糖的含量为六大茶类之首。研究发现，黑茶具有抗氧化[4]、抑菌和降脂减肥[5-6]等多种药理功效，特别是其良好的降脂减肥功效已从细胞、动物和人体等多个方面得到证明，但其降脂减肥的功效成分及作用机理尚不清楚。茶褐素是黑茶中主要的色素类物质，也是重要的功能成分，由茶黄素和茶红素进一步氧化而成，具有良好的降脂减肥功效[7-9]。茶多糖是从茶叶中提取的活性多糖的总称，研究[10]发现，茶多糖具有降低游离脂肪酸的作用。目前，茶褐素和茶多糖对脂肪酶的抑制作用还未见报道，因此本试验拟通过研究不同地区黑茶中茶褐素和茶多糖的降脂减肥功效，为黑茶的保健功效及其进一步开发利用提供科学依据，为寻找天然的降脂减肥材料提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普洱茶(熟茶)：2014年，云南下关沱茶(集团)股份有限公司；

康砖：2014年，四川吉祥茶业有限公司；

茯砖：2014年，湖南省白沙溪茶厂股份有限公司；

六堡茶：2014年，广西壮族自治区梧州茶厂；

脂肪酶(猪胰中提取，PPL，typeⅡ)：酶活力≥30 000 U/g，美国Sigma公司；

4-硝基苯基丁酸酯(p-NPB)、对硝基苯酚(p-NP)、二甲基亚砜(DMSO)、Tris、无水乙醇、95%乙醇、无水丙酮、无水乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇等：国产分析纯；

水浴恒温振荡器：SHY-2A型，常州国宇仪器制造有限公司；

生化培养箱：SPX-250型，上海申贤恒温设备厂；

高速冷冻离心机：2-16K型，美国Sigma公司；

紫外-可见分光光度计：UV-2300型，日本日立公司；

精密微量移液器：WKY III型，上海佳安分析仪器厂；

旋转蒸发器：RE52-86A型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

(1) 脂肪酶液配制：精确称取0.500 0 g脂肪酶于研钵中，加少许Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)研磨，定容至100 mL容量瓶中，静置，4 ℃下12 000 r/min冷冻离心1 min，保存于-20 ℃冰箱中备用，即浓度为5 mg/mL的酶储备液[11-12]。

(2) 底物配制：精确称取一定量的p-NPB，用DMSO配置成浓度为0.01 mol/L的储备液，置于-20 ℃冰箱中备用。

(3) 对硝基苯酚溶液配制：精确称取一定量的p-NP，用DMSO配制成10 μmol/mL的溶液备用。

(4) 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)配制：精确称取6.057 5 g Tris溶于水，定容至250 mL；取25 mL Tris溶液加到含有25 mL 0.1 mol/L HCl的100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。

1.2.2 黑茶茶褐素的制备 分别称取黑茶茶样各40 g，按1∶20 (g/mL)茶水比加入沸蒸馏水，浸提30 min，重复3次，合并浸提液，4层纱布过滤，所得滤液再抽滤，于旋转蒸发仪减压浓缩，得萃取液。萃取液用等体积正丁醇、氯仿、乙酸乙酯萃取3次，合并水相，减压浓缩，干燥[13]。

采用系统比色法[14]检测茶褐素含量。

1.2.3 黑茶茶多糖的制备 分别称取茶样20.0 g，粉碎，在茶水比1∶20 (g/mL)，温度70 ℃的条件下，浸提30 min，趁热抽滤，重复浸提3次，合并滤液，于旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的20%。将浓缩后的茶汤与3倍体积95%的乙醇混合沉淀1 h，再于7 000 r/min离心5 min，得到沉淀物用无水乙醇、丙酮、乙醚交替洗涤2次，并在70 ℃下真空干燥[15]。

采用蒽酮-硫酸比色法[16]测茶多糖含量。

1.2.4 脂肪酶活性测定 取6支试管，分别加入10 μmol/mL 对硝基苯酚1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用DMSO补充到5 mL，以未加对硝基苯酚的空白溶液作对照，在405 nm 波长处测吸光度，以吸光度值为纵坐标，对硝基苯酚浓度为横坐标，得到对硝基苯酚的标准曲线[17-18]。

将0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0) 2 100 μL、酶液300 μL置于37 ℃恒温箱内预热15 min，然后将其注入100 μL底物溶液中，摇床15 min，立即加入无水乙醇5 mL终止反应，以未加脂肪酶的空白溶液为参照，在405 nm波长处测其吸光度值。对照对硝基苯酚标准曲线，即可求得对硝基苯酚的浓度。

脂肪酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1 μmoL 对硝基苯酚的酶量定义为一个酶活力单位(U)。计算公式：

(1)

式中：

X——脂肪酶活力，U/mL；

c——对硝基苯酚的浓度，μmoL/mL；

V——反应液终体积，mL；

t——反应时间，min；

V′——酶液用量，mL。

脂肪酶抑制率的测定按照上述脂肪酶活力的测定方法，先加入定量的Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)、茶褐素(茶多糖)和脂肪酶液，预热，再加入底物溶液，终止反应，测定剩余酶活性，按式(2)计算抑制率。

(2)

式中：

I——抑制率，%；

X——脂肪酶活力，U/mL；

X′——抑制后酶活力，U/mL。

1.2.5 半抑制浓度的测定 测定各黑茶茶褐素(茶多糖)浓度在0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，80.00 mg/mL时对脂肪酶的抑制率，以各黑茶茶褐素(茶多糖)浓度为横坐标，脂肪酶抑制率为纵坐标，作回归曲线，得出半抑制浓度IC50。半抑制浓度越小，抑制能力越强。

1.2.6 脂肪酶抑制动力学的测定 在无抑制剂和适宜浓度的各黑茶茶褐素(茶多糖)条件下，加入一定量质量浓度为0，2，3，4，5 mg/mL酶溶液，按照上述酶活测定方法测定吸光度，计算反应速率。按Dixon作图法，以反应速率对脂肪酶浓度作图，确定抑制类型[19-20]。

将各黑茶茶褐素(茶多糖)稀释至一定的浓度，分别取300 μL 加入至300 μL酶液中，然后将其加入至底物浓度分别为0.001，0.002，0.003，0.004 mmol/L反应体系中，测定酶反应速度。采用Lineweaver-Burk双倒数法，将1/V对1/[S]作图，测定各黑茶茶褐素(茶多糖)对脂肪酶的可逆抑制作用类型。

1.3 数据记录与处理

试验数据采用Excel和SPSS 17.0 软件对数据进行统计处理，所有数据均以均数±标准差 (SE)表示，不同组间的比较采用LSD法进行方差分析，检验水平a=0.05。

2 结果与分析

2.1 受试茶样主要理化成分含量及分析

由表1可知，经过渥堆发酵的4种黑茶中，茯砖茶的多酚类含量最高，为13.96%，其次为康砖，六堡茶和普洱茶的多酚类含量相对较低。通过对茶色素含量的对比分析，表明茯砖茶的茶黄素和茶红素含量分别为0.29%和1.02%，显著高于其他3种；但茶褐素仅为3.17%，显著低于普洱茶(8.17%)和六堡茶(5.91%)。根据这3个主要指标的测定结果，可得出茯砖茶渥堆发酵程度最轻，而普洱茶和六堡茶渥堆发酵程度最重。

2.2 各黑茶茶褐素与茶多糖对脂肪酶活性的影响

在不同浓度的对硝基苯酚溶液下，以不加对硝基苯酚的空白溶液作为对照，得到对硝基苯酚标准曲线为y=0.063 7x-0.018 5，R2=0.999 5。

按照1.2.5所示的脂肪酶的半抑制浓度的测定方法，分别测定普洱茶(熟茶)、六堡茶、茯砖和康砖的茶褐素与茶多糖在浓度梯度为0.00，1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，80.00 mg/mL条件下对脂肪酶抑制效果，结果见图2。

表1 受试茶样主要理化成分含量结果†Table 1 Results of main physical and chemical components in tea samples (n=4) %

† 同列小写字母表示0.05显著水平。

图1 各黑茶不同浓度的茶褐素与茶多糖对脂肪酶活性的影响Figure 1 Effects of different concentrations of tea theabrownin and tea polysaccharide on lipase activity in different black tea

由图1、表2可知，不同黑茶的茶褐素与茶多糖对脂肪酶活性均存在一定抑制作用，且随茶褐素与茶多糖浓度的增加，在一定浓度范围内对脂肪酶的抑制作用呈上升趋势。各黑茶茶褐素抑制脂肪酶活性以普洱茶褐素IC50最小，为25.96 mg/mL，抑制作用最强；茯砖的茶褐素IC50最大，为57.08 mg/mL，抑制作用最小。各黑茶茶多糖对脂肪酶活性抑制作用表现为：普洱茶茶多糖IC50最小，为47.57 mg/mL，抑制效果最好；茯砖茶多糖IC50最大，为662.44 mg/mL，抑制效果最差。

表2各黑茶茶褐素与茶多糖对抑制脂肪酶活性的IC50†

Table 2 Inhibition of lipase activity by tea theabrownin and tea polysaccharide onIC50mg/mL

† 同列小写字母表示0.05显著水平。

2.3 不同黑茶茶褐素与茶多糖对脂肪酶的抑制作用

由图2可知，普洱茶、六堡茶、茯砖茶、康砖茶中存在的茶褐素对脂肪酶均有抑制作用，且抑制类型均为可逆抑制。刘睿等[21]通过在酶活测定体系中加入定量的抑制剂，以不同酶浓度测定酶活力，以酶浓度为横坐标，反应速率为纵坐标作图发现，体系中无抑制剂，该直线通过原点；当体系中存在一定量可逆抑制剂时，亦可得一条斜率相对较低且过原点的直线。各黑茶茶多糖对脂肪酶的抑制类型如图3所示，结果表明普洱茶(熟茶)、六堡茶、茯砖茶与康砖茶中的茶多糖均对脂肪酶有抑制作用，且这种抑制作用类型均为可逆抑制。

2.4 黑茶茶褐素与茶多糖对脂肪酶的可逆性抑制类型

图4为各黑茶茶褐素对脂肪酶的可逆抑制双倒数Lineweaver-Burk作图结果。在Lineweaver-Burk图中，直线交于横轴为非竞争性抑制，交于纵轴为竞争性抑制，交于第二象限为竞争性与非竞争性混合抑制[22]。普洱茶、六堡茶、茯砖、康砖的茶褐素浓度为2.5，5.0 mg/mL时，直线均交于第二象限，通过对比，可以看出图4(b)、(c)的直线交点比其他2个更靠近纵轴，说明其抑制类型为竞争性与非竞争性混合抑制，接近于竞争性抑制作用；而图4(a)、(d)直线的交点稍远于纵轴，说明抑制类型为典型的竞争性与非竞争性混合抑制。

通过对比可以看出图5(b)、(d)的直线均交于第二象限，表明其抑制类型为竞争性与非竞争性混合型抑制作用；图5(a)的直线交于第二象限且直线交点靠近纵轴，说明其抑制类型为竞争性与非竞争性混合型抑制，接近于竞争性抑制类型；图5(c)中，该组直线相交于纵轴，表明其为竞争性抑制类型。

3 结论

(1) 4种黑茶中普洱茶、六堡茶的渥堆发酵程度最重，茯砖茶的渥堆发酵程度最轻，康砖茶居中。通过各黑茶IC50的比较分析可知，普洱茶(熟茶)减肥降脂效果最好，六堡茶次之，茯砖最差，康砖介于六堡茶和茯砖之间。

图2 黑茶茶褐素对脂肪酶的抑制作用Figure 2 Inhibitory effect of different black tea theabrownin on lipase

图3 黑茶茶多糖对脂肪酶的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of different black tea polysaccharide on lipase

图4 黑茶茶褐素对脂肪酶的可逆抑制类型Figure 4 The reversible inhibition type of the different black tea theabrownin on lipase

图5 黑茶茶多糖对脂肪酶的可逆抑制类型Figure 5 The reversible inhibition type of the different black tea polysaccharide on lipase

(2) 4种黑茶茶褐素作用于脂肪酶的抑制类型为竞争性与非竞争性混合型，其中六堡茶接近于竞争性抑制类型。普洱茶、六堡茶与康砖茶多糖的抑制类型为竞争性与非竞争性混合型，其中普洱茶接近于竞争性抑制类型，而茯砖茶为竞争性抑制类型。

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