日本山椒的复叶离体培养与植株高频再生

秦素洁 ，赵玉芬 ，魏安智 3，李国松 4，赵京献 ，郭伟珍

（1.河北省林业科学研究院，河北 石家庄 050061；2.河北省林木良种工程技术中心，河北 石家庄050061；3.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100；4.河北省林木种苗管理站，河北 石家庄 050081）

日本山椒Zanthoxylum piperitumDe Candolle为芸香科花椒属落叶小灌木，株高3 m 左右，雌雄异株，有些变异品种无刺或少刺。其果皮、青果、种子、枝干、嫩芽等均有重要的应用价值。日本山椒喜温暖、湿润的气候条件，其耐寒性、耐热性中等，抗病能力强，尤其具有较强的抗流胶病能力[1-2]。与国内的花椒品种相比，日本山椒优良品种具有丰产与稳产性好、抗逆性强和风味独特、无皮刺、食用及药用价值高等优点[2]。河北省林业科学研究院自2000年以来陆续引进日本山椒品种7个，经过多年的引种试验，确定了石家庄以南地区为日本山椒的适宜栽培区，山东半岛及长江流域为其最佳栽培区域[1]。

花椒生产上以实生繁殖为主，导致了品种退化、产量降低、株间整齐度差等问题的出现。利用组织培养可以快速高效地育苗，从而为生产提供大量的优质苗木。由于受引种的限制，日本花椒目前多采用组织培养、嫁接繁殖等方法[3]进行繁殖；郭伟珍曾对日本朝仓花椒进行了硬枝扦插育苗试验[4]。有关花椒组织培养和再生的研究主要集中在利用花椒带芽茎段进行快速繁殖上[3-11]，也有以花椒叶片、叶柄实现再生的研究报道[5,12-14]。但是，目前相关文献报道的花椒叶片、叶柄离体培养均先通过诱导愈伤组织再进行芽的分化，且存在芽的诱导率低、产生芽的诱导时间长等问题。而对山椒的整个复叶离体高频诱导不定芽直接再生的研究却未见报道。为此，本文探讨了一种简便、高效的山椒复叶离体再生的方法和途径，以期为山椒的组培快繁和遗传育种提供技术支持，同时为其他树种尤其是复叶树种的离体高频再生提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试外植体为‘琉锦山椒’Zanthoxylum piperitum‘Riyujin-Sansho’和‘花山椒’Zanthoxylum piperitum.Var.froma inerme试管苗的复叶。

图1 复叶外植体接种状态Fig.1 Compound leaf explants inoculation

1.2 方 法

1.2.1 叶片离体培养

取继代培养30 d的试管苗中、上部1～3个幼嫩复叶，垂直叶轴横切2刀刻伤，叶背面朝下，将整个复叶平铺接种在不定芽再生培养基上（如图1所示）。每处理10瓶，每瓶接种1个复叶，重复3次。不定芽再生诱导培养基设用如下几种组合培养基：处理Ⅰ为MS＋6-BA 1.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1；处理Ⅱ为 MS ＋ 6-BA 1.5 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1；处理Ⅲ为 MS ＋ 6-BA 2.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1；处理Ⅳ为 MS ＋ 6-BA 3.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1。附加琼脂 6 g·L-1，白砂糖 30 g·L-1，培养基的pH值为5.8。培养室温度设为（25±2）℃，暗培养10 d后转入光照培养，光照强度为2 000 lx，光照时间为16 h·d-1，在此条件下培养20 d，共培养30 d后调查芽的再生芽数量、再生率及生长情况。

采用SPSS数据处理软件进行方差分析，采用Duncan新复极差法进行多重比较。

1.2.2 复叶叶轴刻伤

试验中对整个叶轴进行横切刻伤处理，将同一复叶叶轴上刻伤的程度分为深度（叶轴的2/3）和浅度（叶轴的1/3）两种，以不刻伤为对照。每处理10瓶，每瓶接种1个复叶，重复3次，将‘琉锦山椒’接种在Ⅱ号培养基上，将‘花山椒’接种在Ⅰ号培养基上，其他培养条件同上。培养30 d后调查芽的再生数量和再生率。

1.2.3 继代培养与生根培养

继代培养基设用MS＋6-BA0.5 mg·L-1＋IBA0.2 mg·L-1（即处理Ⅴ）。将复叶离体诱导的不定芽芽丛接种于Ⅴ号培养基上进行继代培养，每隔25～30 d继代培养1次。

生根培养基设用1/4 MS＋IBA 0.2 mg·L-1＋NAA 0.3 mg·L-1＋2.5%蔗糖＋0.6%琼脂（即处理Ⅵ）。当苗高为2.5～3.0 cm时，将其接种在Ⅵ号培养基上进行生根培养，每品种接种5瓶，每瓶10株，重复2次。培养的光照时间为10～12 h·d-1。共培养30 d后调查2个品种的生根率、生根条数及根长度。

2 结果与分析

2.1 不同品种对日本山椒试管苗离体复叶不定芽再生能力的影响

不同浓度的6-BA与IBA组合培养基处理对日本山椒离体复叶不定芽再生的影响情况如表1。由表1可知，不同品种试管苗离体复叶的不定芽再生能力有所不同。在供试的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号培养基上，‘琉锦山椒’诱导芽的再生率分别为83.33%、90%、66.77%、66.77%，每复叶再生芽的数量分别达到了4.17、5.42、5.80、3.61 个；而‘花山椒’诱导芽的再生率分别为80%、76.67%、66.33%、60.33%，每复叶再生芽的数量分别达到了4.16、3.47、2.90、2.26 个。‘琉锦山椒’的芽再生率和再生芽数量均高于‘花山椒’，这与品种的基因型有着明显的关系。

表1 不同浓度的6-BA与IBA培养基处理对日本山椒离体复叶不定芽再生的影响†Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA with IBA on the organ regeneration from in vitro cultured leaves of Z.piperitum DC.

2.2 不同浓度的6-BA与IBA组合培养基处理对日本山椒离体复叶不定芽再生能力的影响

不同浓度的6-BA和IBA组合培养基处理对日本山椒离体复叶的不定芽再生能力有着显著的影响。当IBA的浓度为0.2 mg·L-1时，随着6-BA浓度的增加，‘琉锦山椒’不定芽的再生率和再生芽数量均呈先升高后下降的变化趋势。当6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，‘琉锦山椒’的不定芽再生率为83.33%，每复叶再生芽的数量为4.17 个；当6-BA浓度达到1.5 mg·L-1时，芽再生率最高达到了90%，每复叶再生芽的数量达到5.42 个，芽再生率和再生芽数量均达了显著性差异；当6-BA浓度增加到2.0 mg·L-1时，芽再生率迅速下降，而再生芽的数量达到最高值，与浓度为1.5 mg·L-1的6-BA处理的再生率间存在显著性差异，但其再生芽数量间却无显著性差异；当6-BA浓度增加到3.0 mg·L-1时，芽再生率不再下降，但再生芽的数量却明显减少，和前3种浓度处理间存在5%的显著性差异。随着6-BA浓度的增加，诱导出的芽体逐渐变小。这一结果说明，6-BA浓度的过低或过高都会抑制日本山椒复叶的芽再生率和再生芽的数量，只有适宜的浓度才能达到高频再生。方差分析结果表明，‘琉锦山椒’的最适诱导培养基为Ⅱ号组合培养基，即MS＋6-BA1.5 mg·L-1＋IBA0.2 mg·L-1。

随着6-BA浓度的增加，‘花山椒’的再生芽率、再生芽数量、诱导的芽体大小均呈递减趋势。当6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，其再生芽率与浓度为1.5 mg·L-1的6-BA处理间没有显著性差异，而与浓度分别为2.0、3.0 mg·L-1的6-BA处理间在5%水平上均有显著性差异；其再生芽的数量高于其他3个处理，并达到了1%的极显著性差异水平。分析结果表明，‘花山椒’的最佳诱导培养基为Ⅰ号培养基，即为MS＋6-BA 1.0 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1。

2.3 刻伤处理对日本山椒离体复叶不定芽再生能力的影响

将接种的2个品种复叶暗培养10 d转为光培养5 d后，小叶片开始增厚变绿，部分小叶片翘离培养基面，接种20 d后，均开始有再生芽萌发，但2个品种的表现不同。‘琉锦山椒’深度切伤的断面有少量绿色愈伤组织形成，但是没有产生新的再生芽体；浅度刻伤的伤口自动愈合，没有愈伤组织形成。‘花山椒’深度切伤的断面处形成了较多的淡黄色愈伤组织，也没有芽体生成。复叶的小叶叶腋处不具腋芽，仅有总叶柄叶腋处具腋芽[15]。但在植物生长调节剂调控和刻伤的刺激下，2个品种均在小叶叶腋处（小叶和叶轴连接处）直接产生了不定芽及芽丛（如图2A与B所示）。刻伤处理对日本山椒离体复叶不定芽再生的影响情况见表2。表2表明，与不刻伤处理（对照）相比，刻伤处理对2个品种的复叶离体再生不定芽均有促进作用，但部分叶轴有隆起现象（如图2C所示），仍能正常生长。

图2 ‘琉锦山椒’和‘花山椒’的复叶芽体直接再生情况Fig.2 Regeneration bud of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

表2 刻伤处理对日本山椒离体复叶不定芽再生的影响Table 2 Effects of carved injury on regeneration of leaves in vitro for Z.piperitum DC.

2.4 继代培养与生根培养

2.4.1 继代培养

将复叶离体诱导的不定芽芽丛接种至继代增殖培养基（Ⅴ号培养基，即为MS＋6-BA 0.5 mg·L-1＋IBA 0.2 mg·L-1）上进行壮苗增殖培养，培养25～30 d后继代培养1次，结果分别如图3A与B所示。

2.4.2 生根培养

将生长健壮、苗高在2.5～3.0 cm以上的嫩尖切下接种到Ⅵ号生根培养基上，在生根培养基上培养10 d后，茎基部开始膨大，培养15 d开始有疏松的白色愈伤组织形成，培养20 d有根生成，并迅速伸长，但是，2个品种均存在生根不均匀的现象（如图3 A与B所示）。

图3 ‘琉锦山椒’和‘花山椒’的壮苗与增殖状态Fig.3 Subculture of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

日本山椒离体复叶不定芽的生根表现如表3。由表3可知，培养30 d后，‘琉锦山椒’的生根率、平均生根条数、平均最长根长均略高于‘花山椒’，这可能与品种特性及继代分化培养过程中激素的积累有关。

图4 ‘琉锦山椒’和‘花山椒’的生根状态Fig.4 Roots of ‘Riyujin-Sansho’ and Var.froma inerme

2.5 炼苗与移栽管理

当根长至0.5～1.0 cm时，将试管苗移至炼苗室，打开瓶口炼苗4～5 d。当试管苗生长健壮、叶色转浓绿时可将其移栽到育苗箱的蛭石中，注意洗净培养基，用塑料薄膜覆盖好，温度控制为18～25 ℃，空气相对湿度为85%。幼苗长出新根后逐步揭开薄膜，每隔7 d喷1次杀菌剂和营养液，移栽后的温湿度管理是影响成活率的关键因素。移栽30 d统计得到，‘琉锦山椒’与‘花山椒’的移栽成活率分别达到了79.5%和76%，移栽40 d后可移栽上钵。

3 结论与讨论

日本花椒（山椒）雌雄异株，不同品种之间以及雌株与雄株之间的基因型和表现型均有较大差异。本试验以‘琉锦山椒’和‘花山椒’为材料，在培养过程中芽的诱导率和再生芽数量及生长表现也有很大差异，其受基因型的影响较大，相对于‘琉锦山椒’而言，‘花山椒’所需激素水平要低些。

以往的花椒叶片离体培养研究中报道，不论是田间幼叶还是试管苗幼叶，大多采用了低细胞分裂素（6-BA 0.3 ～ 0.5 mg·L-1或 TDZ 0.03 mg·L-1）与低浓度生长素（2,4-D 0.2～0.5 mg·L-1、NAA 0.05～0.20 mg·L-1）配比的培养基。姜长阳等人[12]报道了以花椒幼叶为外植体，以MS＋BA 0.5 mg·L-1＋2-4D 0.2 mg·L-1＋ NAA 0.05 mg·L-1和 MS ＋ BA 0.3 mg·L-1＋ NAA 0.1 mg·L-1培养 120 ～ 130 d 后愈伤组织分化芽的诱导率达到10%。王港等人[13]以‘凤椒’嫩叶为试材，以MS＋2,4-D 0.5 mg·L-1＋BA 0 .5 mg·L-1为培养基，结果产生的愈伤组织诱导率达到90%；在MS＋TDZ 0.03 mg·L-1＋BA 0.1 mg·L-1中培养 60 d后其愈伤组织分化芽的诱导率达70%。曾晓芳分别以日本‘朝仓花椒’试管苗的叶片、叶柄为试材，以WPM＋6-BA 0.5 mg·L-1＋NAA 0.2 mg·L-1为最佳培养基，叶片的愈伤组织分化率最高仅为2.52%，叶柄的诱导分化率最高为60%，且培养60 d才分化出芽，他们因此认为，叶片不适合作为外植体进行培养[15]。

有些研究者认为，细胞分裂素的浓度对增值系数的影响存在极显著差异[16-19]。王瑞等人认为，细胞分裂素浓度越高，增值系数则越大[16]；而秦新惠等人认为，随着6-BA质量浓度降低，增值系数越来越高，降至0.1～0.5 mg·L-1，增值系数达到最大[17]；陈容等人、暴甜等人的研究结果均表明，6-BA浓度过高或过低均不利于不定芽的形成和增殖[18-19]，这与本试验结果“6-BA（细胞分裂素）浓度过低或过高均不利于芽的再生”一致。当6-BA 1.0 ～ 1.5 mg·L-1与 IBA 0.2 mg·L-1的配比为5.0～7.5∶1.0时，培养30 d，‘琉锦山椒’与‘花山椒’的再生芽诱导率分别达到90%和80%，每复叶的再生芽数量分别达到5.42和4.16 个，高于王平等人[20]对蚬壳花椒试管苗叶片的试验结果（经愈伤组织诱导后，在6-BA 0.5 mg·L-1＋NAA 0.1 mg·L-1培养基上，不定芽再生率为61%，再生芽数量达到3.2个）；李晓东等[21]选取胡椒木当年生枝条的幼嫩叶片作为外植体，将其接种在MS ＋ 6-BA 1.0 mg·L-1＋ NAA 0.7 mg·L-1，经过 6 周的培养，芽的诱导分化率最高达到91.7%。本试验结果与李晓东等人的诱导率相近，但芽的诱导时间比其缩短了近2周。

前人对苹果试管苗的研究结果表明，不同切伤方法对叶片发生不定芽能力的影响没有明显差异，而切伤与不切伤对叶片不定芽的发生能力却有很大影响，从再生率、每叶发生的不定芽数、再生力等方面看，切伤处理的均比不切伤的高，这说明切伤是促进不定芽发生的重要刺激因素[22]。柴慈江等人研究了珠美海棠叶片不同的切伤方式，结果表明，以横切主脉处理的切口处芽的再生率为最高[23]。本试验在叶轴上刻伤后，对不定芽的再生有明显的刺激作用，提高了芽的再生率和再生芽数量，这与孙清荣在苹果叶片上的研究结论一致[22]。

离体培养过程中出现了部分小叶和部分叶轴拱起而脱离了培养基表面的现象，但是，再生芽生长没有受到影响，部分叶轴拱起可能是由切伤和叶片的增厚所致，但不影响营养物质的运输。本试验中还出现了另外一种现象，即叶轴的中后端比前端容易诱导出芽，这可能与复叶不同部位的组织成熟度有关。

总之，以‘琉锦山椒’与‘花山椒’试管苗复叶离体培养，直接诱导不定芽的再生体系，不仅越过愈伤组织阶段，且再生率及再生芽数量均较高，大大缩短了外植体的出芽时间。以试管苗复叶为外植体，取材数量多、便捷、极大地降低了外植体的污染率，经过直接器官发生途径诱导分化的不定芽，转接到壮苗继代增殖培养基上能正常生长发育，且能在生根培养基中生根。山椒复叶离体诱导不定芽的直接再生是山椒离体高频再生的新途径。本文仅对日本山椒的2个品种的复叶进行了离体培养和再生试验，而对其他品种特别是国内花椒品种的相关研究尚需深入展开。

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