E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化

尹彩霞，于少雄，宋琨，李素，杨玉莹，仇华吉



E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化

尹彩霞1，2，于少雄2，宋琨2，李素2，杨玉莹1，仇华吉2

（1长江大学动物科学学院，湖北荆州 434025；2中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 150069）

【目的】已有研究显示，猪瘟病毒（CSFV）通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞，然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒，将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系，利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白，同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验，进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系，与对照细胞相比可见明显的绿色荧光，表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示，在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带，经Western blotting验证，上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别，表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件，悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84 μg·mL-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示，重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用；阻断ELISA和中和试验结果显示，针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染，且具有良好的中和活性；吸附试验和内化试验证明，重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化，而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。

猪瘟病毒；E2蛋白；悬浮细胞系；吸附；内化

0 引言

【研究意义】猪瘟（classical swine fever，CSF）是一种由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的高致病性、高死亡率的急性传染病，对很多国家养猪业造成重大经济损失[1-2]。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属成员，病毒粒子有囊膜，基因组是一条长约12.3 kb的单股正链RNA[3-4]。CSFV的复制周期包括吸附、内化、膜融合、早期蛋白质的合成、基因组复制以及病毒粒子的装配和释放等，其中病毒的侵入作为其复制周期的初始环节，对病毒的繁殖发挥决定性作用。瘟病毒属成员大都利用受体介导的内吞作用侵入宿主细胞[5-7]，最近报道，CSFV利用受体介导的网格蛋白依赖的内吞作用侵入宿主细胞，该进程在低pH环境下进行，依赖动力蛋白和胆固醇，同时需要Rab5和Rab7的参与[8]。在侵入过程中，CSFV利用自身囊膜蛋白与细胞膜表面受体分子发生相互作用，目前，在吸附受体方面的研究已经取得一定进展，但内化受体仍有待鉴定。总之，对侵入机制的研究不仅能够明确病毒的感染和发病机理，更为抗病毒治疗提供新型的药物靶标，因此，研究CSFV的侵入机制具有重要的科学意义。【前人研究进展】Erns、E1和E2是位于CSFV表面的3种囊膜蛋白[9]，Erns通过与吸附受体作用介导CSFV的吸附，已知的CSFV吸附受体包括硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）[10]和层粘连蛋白受体（laminin receptor，LamR）[11]，CD46分子被鉴定为CSFV的吸附因子[12]。E2蛋白位于病毒粒子表面，与E1蛋白形成异源二聚体，是CSFV重要的抗原蛋白，可诱导机体产生中和抗体[13]。在伪型病毒侵入试验中，证明E1和E2蛋白足以介导CSFV侵入易感细胞[14]。CSFV的侵入包含吸附和内化过程，在吸附过程中，通过吸附受体与囊膜蛋白结合使病毒粒子富集在宿主表面，随之病毒粒子与宿主细胞的空间距离和细胞内部环境发生变化，使病毒囊膜蛋白发生变构，进一步与内化受体结合，从而介导病毒的内化[15]。【本研究切入点】目前，明确参与CSFV侵入的囊膜蛋白包括Erns、E1和E2，但具体哪种蛋白、如何介导CSFV的吸附和内化仍然未知。【拟解决的关键问题】通过探究重组E2蛋白对CSFV吸附和内化的影响，明确E2蛋白是否参与CSFV吸附和内化，为发现CSFV细胞受体提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

研究在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室完成。PK-15细胞和CSFV石门株由本团队保存，悬浮293细胞购自上海源培生物科技股份有限公司，针对CSFV E2蛋白的单克隆抗体WH303[16]由英国动植物卫生机构（APHA）Trevor Drew教授提供，pMD19-T simple载体购自宝生物工程有限公司，pLVX-IRES-ZsGreen1载体购自Clontech公司，psPAX2和pMD2.G慢病毒包装辅助质粒购自Addgene。

1.2 引物设计与合成

为了构建重组E2蛋白的表达载体，根据CSFV E2基因全长序列设计引物，在E2基因5¢端引入R I酶切位点，3¢端去除编码跨膜区的基因片段，引入Flag和Strep双标签（两个标签之间以TEV酶切位点连接）以及I酶切位点，并由上海英骏生物技术有限公司合成，序列如下（斜体字分别为R I和I酶切位点，下划线处分别为Strep标签、TEV酶切位点和Flag标签）：SME2-F：5'-CGGCCACCATGG TATTAAGAGGGCAGATCGTGC-3'；SME2-R(FTS)：5'-CCCTATTCTGCGAAGTAATCTGAGTGG-3'。

1.3 重组E2蛋白真核表达载体的构建

以CSFV石门株cDNA为模板，利用Ex-Taq酶扩增E2基因片段。回收PCR产物，连接至pMD19-T simple载体。测序正确后，以该重组质粒为模板，利用PrimeSTAR高保真酶扩增包含Flag和Strep双标签的E2基因片段，将其插入pLVX-IRES-ZsGreen1载体中，得到重组质粒pLVX-SM-E2-FTS。

1.4 包含E2基因的慢病毒的包装

将HEK-293T细胞铺入六孔板，待细胞汇合度达到80%后进行转染。首先，把细胞培养液换成含10% FBS的DMEM，同时将重组质粒pLVX-SM-E2-FTS、辅助质粒psPAX2和pMD2.G与X-tremeGENE HP DNA转染试剂（罗氏公司）配成转染复合物，静置20 min后加到细胞上清中，培养48 h后收获细胞上清，5 000×离心去除细胞碎片，分装后贮存于-80℃冰箱中，得到慢病毒Lenti-SM-E2-FTS。

1.5 表达E2蛋白的悬浮293细胞系的构建

将悬浮293细胞培养传代至细胞稳定生长之后，按感染复数（multiplicity of infection, MOI）为1用重组慢病毒Lenti-SM-E2-FTS进行转导，得到悬浮细胞系293-SM-E2。37℃培养48 h后，换成新鲜的培养基。待细胞生长状态稳定后，倒置荧光显微镜下观察细胞转导水平。

1.6 重组E2蛋白的纯化

将细胞悬液倒入50 mL离心管，500×离心5 min后，收取上清到新管，用10 kD超滤管（Merck Millipore公司）将含有重组蛋白的上清液从100 mL浓缩至10 mL。将高亲和力Strep标签树脂（GE公司）填入层析柱中，用预冷的PBS洗5次，之后加入浓缩的蛋白，于4℃条件下翻转结合过夜，弃去穿流液后，用PBS洗5次以除去未结合的蛋白，用脱硫生物素（Sigma公司）于4℃条件下洗脱。

1.7 SDS-PAGE电泳及Western blotting

将纯化的蛋白加入5×loading buffer后煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳，之后转印到硝酸纤维素薄膜上，经5%脱脂乳封闭1 h后，用抗E2蛋白单克隆抗体WH303于室温孵育2 h，用PBS洗5次，加入IRDye800CW山羊抗小鼠IgG抗体（LI-COR Bioscience公司）避光孵育1 h，再用PBS洗5次，利用近红外荧光成像系统（Odyssey）扫描并读取结果。

1.8 抗E2蛋白多克隆抗体的制备及检测

将20 μg纯化的重组E2蛋白与QuickAntibody- Mouse3W免疫佐剂（北京博奥龙公司）混合后，通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠，一免后2 w以相同的剂量进行二次免疫，二免后1 w采血并分离血清，利用猪瘟抗体检测试剂盒（IDEXX公司）检测E2蛋白特异性抗体水平，最后摘除眼球采血，分离血清，得到抗E2蛋白多克隆抗体（抗E2多抗），保存于-20℃备用。利用中和试验检测抗E2多抗的中和滴度，具体操作步骤参照欧盟猪瘟诊断手册有关抗体检测部分。

1.9 细胞总RNA的提取及荧光定量RT-PCR

RNA的提取步骤参照Life Technologies公司的TRIzol试剂说明书进行，利用反转录酶（宝生物工程有限公司）将RNA反转录为cDNA，通过荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测CSFV基因组拷贝数，操作参照ZHAO等的报道进行[17]。

接着，查理也送给盛旦老师一个硕大的信封。盛旦老师打开信封，大声念出上面用金色笔写的字：一张牌可以快乐享受退休的日子。

1.10 蛋白阻断试验

重组E2蛋白对CSFV感染的影响：将不同浓度重组E2蛋白（0、10、20和40 μg·mL-1）与MOI为0.1的CSFV混合后加入到PK-15细胞中，37℃感染48 h后检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度。

重组E2蛋白对CSFV侵入的影响：将不同浓度重组E2蛋白（0、10、20和40 μg·mL-1）与MOI为0.1的CSFV混合后加入到PK-15细胞中，37℃培养2 h，弃掉上清后换成含2% FBS的DMEM，37℃感染48 h后检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度。

重组E2蛋白对CSFV吸附的影响：将不同浓度重组E2蛋白（0、10、20和40μg·mL-1）与MOI为1的CSFV混合后加入到PK-15细胞中，4℃吸附PK-15细胞2 h，弃去上清后用PBS洗细胞3次，以去掉未吸附的病毒粒子，加入含2% FBS的DMEM，37℃感染48 h后检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度。

1.11 吸附和内化试验

将PK-15细胞铺入24孔板，待细胞生长48 h后进行吸附和内化试验。在吸附试验中，将阴性血清和不同稀释度的抗E2多抗（1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400和1﹕800）与MOI为1的CSFV在4℃感作2 h，同时将PK-15细胞在4℃条件下预冷15 min，再将处理后的病毒加到PK-15细胞中，4℃吸附2 h，弃掉上清后，用PBS洗细胞3次去掉未吸附的病毒粒子，用TRIzol试剂裂解细胞提取总RNA，RT-qPCR检测病毒基因组拷贝数。

在内化试验中，将不同浓度重组E2蛋白（0、10、20和40 μg·mL-1）与MOI为1的CSFV混合后加入到PK-15细胞中，4℃吸附2 h，然后转至37℃培养2 h以完成内化，或将MOI为1的CSFV接种于PK-15细胞，在4℃吸附2 h，用PBS洗细胞3次以去掉未吸附的病毒粒子，再加入阴性血清或不同稀释度的抗E2多抗（1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400和1﹕800）在4℃感作1 h，然后转至37℃培养2 h以完成内化，将以上的细胞用PBS洗3次后，依次用0.05%的胰酶处理2 min、stripping buffer处理1 min、0.5 mg·mL-1的蛋白酶K处理2 min，以除去吸附到细胞表面但未内化的病毒粒子[18-19]，用TRIzol试剂裂解细胞提取总RNA，RT-qPCR检测病毒基因组拷贝数。

1.12 抗体封闭试验

将PK-15细胞铺24孔板，待细胞汇和度达到80%后进行试验，将阴性血清和不同稀释度的抗E2多抗（1﹕50、1﹕100、1﹕200、1﹕400和1﹕800）与MOI为0.1的CSFV在37℃感作2 h，再加入PK-15细胞中，感染48 h后，收取上清测定病毒滴度，利用间接免疫荧光试验检测细胞内病毒感染量[20]。

2 结果

2.1 重组CSFV E2蛋白的表达与鉴定

2.1.1 表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系建立 通过慢病毒转导的方法建立悬浮293细胞系，倒置荧光显微镜下可见明显的绿色荧光（图1-a），表明慢病毒转导成功。利用Strep标签树脂通过亲和层析的方法纯化目的蛋白，经SDS-PAGE和Western blotting检测（图1-b、c），与对照组相比，在还原和非还原条件下分别在55—70 kD之间以及130 kD处各呈现一条特异性条带，为E2蛋白单体和二聚体形式，表明构建的悬浮细胞系可稳定表达重组E2蛋白。

2.1.2 重组E2蛋白表达条件的优化 慢病毒载体携带ZsGreen1荧光标记，因此，采用流式细胞分选系统进行阳性细胞的分选以增加蛋白表达量（结果未显示）。为了优化重组蛋白表达，将悬浮293细胞系传至125 mL的细胞瓶，在相同的培养条件下，分别在第2、4、6、8、10和12天收集培养上清，经Strep标签树脂纯化后测定蛋白浓度，结果显示，在培养至第8 天时重组蛋白表达量最高，上清中的浓度约为5.84 μg·mL-1（图1-d）。

a：检测慢病毒转导的293悬浮细胞的荧光水平；b：SDS-PAGE鉴定重组E2蛋白；c：Western blotting鉴定重组E2蛋白；d：重组E2蛋白表达时间的优化。M：蛋白分子量标准；1和3：293细胞上清中纯化的蛋白；2和4：293-SM-E2细胞上清中纯化的蛋白

2.2 重组E2蛋白抑制CSFV感染

为了验证重组E2蛋白对CSFV感染的影响，用重组E2蛋白预处理细胞30 min，接种CSFV后培养2 h，换成含2% FBS的DMEM，48 h后检测病毒基因组拷贝数和病毒滴度，结果显示，重组E2蛋白预处理细胞对CSFV感染没有影响（结果未显示）。已有研究显示，CSFV E2蛋白与宿主细胞表面受体结合力不强[21]，因此，将不同浓度的重组E2蛋白和CSFV混合后加入到PK-15细胞中，48 h后检测重组E2蛋白对CSFV感染的影响，结果显示，与对照组相比，病毒基因组复制水平和病毒滴度均显著下降（图2-a、b）。以上结果表明，制备的重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。

a：RT-qPCR检测CSFV基因组拷贝数；b：病毒滴定检测CSFV病毒滴度。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；ns，不显著，P > 0.05。下同

2.3 E2蛋白参与CSFV的吸附

CSFV侵入过程包含吸附和内化阶段，利用囊膜蛋白与吸附受体互作后，进一步通过内化受体将病毒内吞到宿主细胞内，然后起始病毒基因组的翻译、转录及复制等功能。先利用蛋白封闭试验验证E2蛋白对CSFV侵入的影响，结果显示，与对照组相比，病毒基因组复制水平和病毒滴度均显著下降（图3-a、b），表明E2蛋白参与CSFV的侵入。进一步验证E2蛋白对CSFV吸附的影响，结果显示，与对照组相比，病毒基因组复制水平和病毒滴度均无显著差异（图3-c、d）。这表明，重组E2蛋白不能阻断CSFV对细胞的吸附。

为了进一步明确E2蛋白对CSFV吸附的影响，免疫BALB/c小鼠制备抗E2多抗，经阻断ELISA试剂盒检测，血清均发生阳转（结果未显示）；中和试验结果显示，抗E2多抗的中和滴度可达1 600—5 120（图4-a）。为了验证抗E2多抗对CSFV的封闭效果，利用不同稀释度的抗E2多抗进行抗体封闭试验，结果显示，与阴性血清相比，抗E2多抗对CSFV的感染具有显著的抑制作用，50倍稀释时可使病毒滴度降低约1 000倍（图4-b、c）。接下来按照该抗体和CSFV的使用浓度进行吸附试验，用不同稀释度的抗E2多抗处理CSFV后进行吸附试验，结果显示，封闭CSFV表面的E2蛋白后显著地降低了CSFV对PK-15细胞的吸附水平（图4-d）。以上结果表明，E2蛋白参与CSFV的吸附。

2.4 E2蛋白介导CSFV的内化

为了探究E2蛋白对CSFV内化的作用，首先，利用重组E2蛋白进行内化试验，结果显示，重组E2蛋白能够显著抑制CSFV的内化水平，处理浓度为2.5 μg·mL-1时抑制效率可达50%左右，且随着蛋白浓度的增加，其抑制水平显著增强（图5-a）。氯丙嗪（chlorpromazine，CPZ）是一种通过抑制网格蛋白形成从而抑制病毒内化的药物抑制剂[22]，利用该试剂作为对照，结果显示，其对CSFV内化有明显的抑制作用（图5-b）。随后，为了佐证E2蛋白参与CSFV的内化，利用抗E2多抗进行内化试验，结果显示，与对照组相比，CSFV的内化水平无显著差异（图5-c），表明抗E2多抗不能通过封闭吸附到宿主细胞上的CSFV而抑制CSFV的内化。

a、b：在侵入过程中加入重组E2蛋白对CSFV感染的影响；c、d：在吸附过程中加入重组E2蛋白对CSFV感染的影响

a：用中和试验检测抗E2多抗的中和效价；b、c：抗E2多抗处理CSFV后对其感染的影响；d：抗E2多抗处理CSFV对其吸附的影响

a：重组E2蛋白对CSFV内化的影响；b：氯丙嗪处理细胞对CSFV内化的影响；c：抗E2多抗处理CSFV对其内化的影响

3 讨论

E2蛋白是CSFV的主要保护性抗原之一，不仅可以诱导机体产生中和抗体，而且能激活机体的细胞免疫应答[23-24]。该蛋白是CSFV重要的毒力决定因子，与病毒的致弱机制相关[25]。通过表达CSFV囊膜蛋白的伪型病毒研究病毒感染的机制，证明E2蛋白是参与CSFV侵入的关键蛋白，但与其互作的细胞受体仍然未知[14]。近些年，相继有研究人员尝试了CSFV受体筛选相关的研究，但始终没有突破性进展，分析可能受病毒粒子与宿主特定的作用关系的限制，因此，解析参与CSFV侵入的关键囊膜蛋白和宿主的作用机制，可以推进这一进程的发展。

黄病毒科代表成员丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的侵入是由病毒粒子表面多个囊膜蛋白与宿主蛋白协同互作，从而引发的一系列反应[26-27]。CSFV是否也与同科病毒具有类似的侵入机制？由Erns蛋白与宿主相互作用起始侵入环节，之后引发其他囊膜蛋白与一个甚至多个宿主分子作用后完成整个侵入进程？在这其中还需要哪些宿主分子的参与？这都是未来亟待解决的问题。在本研究中，笔者初步探索了E2蛋白在CSFV吸附和内化中的作用，而没有涉及参与CSFV侵入的其他蛋白分子，包括Erns蛋白是否参与CSFV内化的研究，或者E1和E2蛋白之间是否通过二聚体形式与宿主细胞发生相互作用，从而引发网格蛋白介导的内吞作用等。

本研究通过慢病毒系统构建了以分泌形式表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系，同时制备了针对重组E2蛋白的多抗，抗体封闭试验证明，E2蛋白参与CSFV吸附（图4-d），利用重组E2蛋白进行内化试验证明，E2蛋白参与CSFV的内化（图5-a），有趣的是，当CSFV吸附到细胞表面之后再加入抗体进行内化试验，则对CSFV内化无显著影响（图5-c）。据此推测，介导CSFV吸附的细胞受体也能将其内吞进细胞内。另外，用重组E2蛋白预处理PK-15细胞后，无法阻断CSFV的感染，然而，在细胞培养上清中添加重组E2蛋白却显著抑制CSFV的感染。由此推测，重组E2蛋白与宿主细胞的结合力较弱，但是能够通过关键位点的“位阻效应”阻断CSFV的感染。这表明，全长E2蛋白并不适合CSFV受体的筛选。尽管如此，能够结合宿主细胞且阻断病毒感染的肽段具有一定的应用价值[28-29]。

4 结论

4.1 通过慢病毒系统成功构建了稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系；

4.2 通过蛋白阻断和抗体封闭试验证明，E2蛋白参与CSFV的吸附和内化。

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（责任编辑 林鉴非）

The E2 Protein Mediates the Attachment and Internalization of Classical Swine Fever Virus in Cells

YIN Caixia1, 2, YU Shaoxiong2, SONG Kun2, LI Su2, YANG Yuying1, QIU HuaJi2

(1Collegeof Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology / Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069)

【Objective】It has been shown that the entry of classical swine fever virus (CSFV) into host cells is mediated by clathrin-mediated endocytosis. However, the viral protein involved in entry stage remains to be elucidated. This study aimed to clarify the role of the E2 protein in the entry of CSFV. 【Method】Lentivirus carrying the E2 gene were packaged by transient transfection of HEK-293T cells. A cell line stably expressing the E2 protein was established through transducing the suspension 293 cell with the lentiviruses. The expression of the recombinant E2 (rE2) protein was optimized to achieve higher production, and the rE2 protein was purified by affinity chromatography. The expression level and reactivity of the rE2 protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting. The effects of the E2 protein on CSFV infection, attachment and internalization were determined by respective assays. Polyclonal anti-E2 antibodies were prepared by immunizing BALB/c mice with the rE2 protein, and its blocking rate was determined by blocking ELISA. Attachment and internalization assays were performed using the prepared polyclonal antibodies to demonstrate the role of the E2 protein in virus attachment and internalization. 【Result】The cell line 293 was successfully transduced with the lentivirus vector. The SDS-PAGE produced the anticipated band size of rE2 no matter the sample was treated with the reducing agent or not. Western blotting results showed that the rE2 protein could be recognized by the anti-E2 monoclonal antibody WH303. The results indicated that suspension 293 cell line could stably express the rE2 protein. Under the optimized expression condition, the concentration of the rE2 protein in the supernatants of the established suspension 293 cell line was up to 5.84 μg·mL-1. Soluble protein blocking assay results showed that the expressed rE2 protein exerted antiviral activity during the process of CSFV infection. CSFV infection were significantly inhibited by the rE2 protein treated in the entry step; Blocking ELISA and serum neutralization test showed that the anti-E2 polyclonal antibodies could neutralize CSFV infection; at the same time, attachment and internalization assays demonstrated that CSFV internalization could be inhibited by the rE2 protein and viral attachment was blocked by the polyclonal antibodies. 【Conclusion】The E2 protein was involved in attachment and internalization of CSFV.

classic swine fever virus; E2 protein; suspension cell line; attachment; internalization

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.018

2017-12-13；

2018-04-16

国家自然科学基金重点项目（31630080）

尹彩霞，E-mail：yincaixia92@163.com。通信作者仇华吉，E-mail：huajiqiu@hvri.ac.cn