专用悬浮饲料养殖鳜鱼核心技术讲座第七讲：饲料养鳜常见疾病防治与暴发性病毒传染病免疫进展（下）

饲料养殖鳜鱼核心技术突破者

吴遵霖 吴 凡 万 星 陈 里

虹彩病毒脾脏涂片

虹彩病毒灭活疫苗

四、暴发性病毒传染病

1.病原体：现发现主要由两种彩虹病毒感染所引起。大型球状彩虹病毒（ISKNV）,依症状亦称鳜传染性脾肾坏死病毒；鳜蛙彩虹病毒（MRV）。

2.病毒病症状特点：

病鱼口腔周围、鳃盖、鳍条基部和尾柄处充血，有的病鱼眼球突出或有蛀鳍现象；大部分病鱼鳃、肝脏发白，内脏器官充血，特别是胃部有块状充血，伴有腹水，肠内充满黄色黏液，往往与寄生虫及细菌交叉感染。

大型球状彩虹病毒,突出症状是鳜传染性脾肾坏死。除腹胀，鳍基部充血，偶有体表溃烂外，解剖腹腔有积液，肝白缺血症状。

3.流行情况：

本病发生于单养鳜鱼池中，主要发生于鱼种和成鱼养殖阶段，大多呈急性流行，传染性强，发病率在50%左右，死亡率可达50%～90%以上。

流行高峰期江西省为7-9月，广东为5-10月，流行水温为20～30℃，主要危害10cm以上的鳜鱼种。现在鳜鱼苗种主要产区的广东,一般须在采购前先进行病毒检测。可见苗种携带病毒的危险成为外地采购的重要忌惮。

4.防治方法：

常用防治方法：保持水质良好，增强鱼体抵抗力，采取措施控制早期病情发展以及定期泼洒含氯制剂（二氧化氯、溴氯海因、二溴海因等）或聚维酮碘水溶液等来预防此病；发病后可用巨威碘、双氧氯全池泼洒，隔天1次，连续泼洒2～3天，并同时将乳酸、恩诺沙星与维生素C、维生素E提前1小时喂饵料鱼，再用饵料鱼投喂鳜鱼，连续2～3天。

但是常用防治方法预防效果有限,以对草鱼等病毒病防治效果来看，采取免疫治疗的方法一直为健康养殖鳜鱼科研院所所采取。研究较早的珠江水产研究所吴淑琴研究员和中山大学海洋学院何建国教授都曾对鳜鱼病毒病进行过深入研究。中山大学与广东永顺、广州渔跃、北京时信等公司研制及中试，已对鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）病灭活疫苗（NH0618株）在2016年新药注册初审，2017年技术审查基础上，现已进入第三方复审阶段，可望今年获得新兽药证书。据称：“鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）病发病现场快速检测方法是将濒死鳜鱼解剖取出脾脏，镊子夹着以脾脏的横切面在干净的载玻片上；轻印几下，然后将细胞涂片置于预冷的无水甲醇中固定约10min自来水冲洗后，用新鲜配置的10%Giemsa染液常温染色30min自来水冲洗后，在正置像差显微镜下镜检（如图）”。广大鳜鱼养殖户翘首期待效果显著使用方便的鳜病毒病疫苗早日问世。据研制者称：“实验室免疫保护效果100%,田间试验免疫保护效果95%以上。不同种株间可交叉保护”。由此可见，鳜鱼彩虹病毒（ISKNV）、（MRV）是目前鳜鱼养殖危害性很大，且无法完全防控治疗的恶性疾病；免疫治疗虽已试验成功，但应用于养殖生产还有一个过程。只有通过综合防治使病毒病不发生或早发现早治疗，加强深入研究（包括民间偏方与中草药防治），尽量减少鳜病毒病对新兴饲料养鳜产业的损失。

五、其它严重侵袭性疾病

20世纪90年代以前，涉及鳜鱼疾病的报道很少，仅少量一般性侵袭性疾病的发生，但随着鳜鱼养殖规模的逐年扩大，特别是在大规模高密度的养殖条件下，局部的水质恶化和拥挤胁迫往往会引起鳜鱼体质下降，并且高密度的养殖环境又有利于病原体的传播和扩散，因此导致鳜鱼侵袭性疾病的频繁发生，其危害性不容忽视。

1.烂鳃病

①病原体：柱状屈桡杆菌。

②症状特点：

病鱼鳃丝末端溃烂成残缺不全，鳃丝软骨外露，鳃烂处常黏附污泥，看上去很脏。病鱼鳃盖内表皮往往充血发炎，严重者主鳃盖中央部位的内表皮溃烂，形成一个透明小区，俗称“开天窗”。

③流行情况：

流行高峰期为5-9月，水温为15～30 ℃，水温越高，越容易发生，且病情越严重。鱼种发病率高于成鱼。当鱼体受伤、放养密度大、水质不良时，可促进其流行。

④防治方法：

定期泼洒生石灰液可防此病。发病时可用五倍子2～4mg/kg，磨碎后浸泡过夜全池泼洒；也可全池泼洒二氧化氯0.2～0.3mg/kg或二氯海因0.4mg/kg等含氯制剂。

2.败血症

①病原体：主要由嗜水气单胞菌等细菌所引起。

②症状特点：

病鱼体表光滑，鳍条和臀鳍基部充血，有时口腔、上下颌、鳃盖、眼眶及体表两侧充血，肝、脾肾肿大，肝肾颜色变浅呈淡红色。流行情况：发病高峰期为7-9月，鱼种、成鱼都会感染发病，水质较差和防病措施不严更容易发生。

③防治方法：

定期泼洒生石灰或二氧化氯以调节水质可防此病。发病时可用二氯异氰尿酸钠（优氯净）0.5mg/kg或漂粉精0.4～0.5mg/kg全池泼洒，同时在100kg饲料中加10kg灰茎辣蓼（粉碎后温水浸泡）均匀拌和、晾干，于15：00-16：00按鱼体重10%投喂池塘中饵料鱼，连喂2～3天。

琼脂培养基配方

琼脂平板培养皿

六、药敏试验

药敏试验是一种防治鱼病前预先在鱼体外测定药物抑菌或杀菌效能的试验,用以作为选择药物与剂量参考。稍有水产养殖科研条件的单位经常使用此种比较科学的测试方法，但很少在技术资料中看到。故笔者在饲料养鳜中特作如下推荐和简单介绍：

1.药敏试验的目的意义：

抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学地、盲目地滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。

对于鳜鱼这种生性娇贵、易患各种侵袭病菌性疾病的名贵鱼，随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好地掌握药物对细菌的敏感度，通过药敏试验可得到一个正确的结果，可作为养殖场选用抗菌药物的参考，可提高疗效。

2.药敏试验常用方法——纸片扩散法、稀释法和牛津杯法

以下介绍常用于简易定性测试的纸片扩散法。纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的最小抑菌浓度（MIC）呈负相关。

①实验材料准备

普通营养琼脂培养基∶可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基；做沙门氏菌可选择血清培养基。

药敏片的准备：（购买或自制制备方法）取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15～20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25mL，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3～6个月。

②仪器：接种环、酒精灯、移液器、滴头

药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

药敏片法：在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。）

将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能准确地观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

③试验结果观察

在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

药物敏感实验判定标准：药敏实验结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

药物敏感实验判定标准参考表1，多黏菌素抑菌圈：在9mm以上为高敏，6～9mm为低敏，无抑菌圈为不敏。

表1 药物敏感实验判定标准表

④药物敏感性影响因素

A、培养基

细菌药敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO组织统一要求的M-H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质，因此进行的药敏试验效果较好。此外，还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到触媒的作用。但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。例如，流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的药敏试验培养基用加5%羊血的巧克力M-H琼脂；肺炎链球菌的药敏实验用M-H琼脂加5%的脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的Ca、Mg，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。

细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐药;若小于4mm，本应耐药的易出现敏感。所以，试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水，主要是Ca、Mg、A1等矿物质离子，也在很大程度上影响着药敏试验的结果。

B、试纸片

试纸片材质的好坏，对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对药物保存无太大影响。然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的试纸片药物有较大的影响。药敏纸片的pH值一般要求为中性，这样才适合药的活度。药敏纸片的厚度要求大约1mm，这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏纸片的直径在6.00～6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。

含药纸片的片间差和质量好坏是做药敏试验的关键。一些药敏纸片买来时就有抑菌环偏大或偏小的问题，纸片之间又存在很大的片间差。因此，纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意纸片的保存，因为有的纸片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。因此，纸片应放低温下（-10℃）保存，同时要避免潮湿，以保持抗菌药物的活性。盛纸片小瓶自低温处取出应在室温平衡至少10min后再打开，避免冷凝水影响药效。

C、细菌

由于各种菌对药物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果菌种不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的药敏试验。药敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1.5亿/mL左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有药物产生耐药；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，来确定菌液浓度。国家细菌耐药性监测网的三级甲等医院，其微生物实验室大多数用此法来确定药敏试验的菌液浓度。

药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴药敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时，每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口，避免药敏纸片之间相互混淆，以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比，药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根据一种药物抑菌圈的有无或者大小，只能判断出该药对细菌有没有效果，但其敏感性的高低需要通过科学严谨的实验来确定。药物的敏感程度需要根据药敏试验的结果，并结合以上因素做综合分析，才能得出科学的结论，而片面地根据药敏圈的大小来决定敏感与否，结果不够准确。

D、培养时间

一般培养温度和时间为37℃、8～18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2～4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

⑤应用于治疗效果

药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。

此处介绍的是常用于简易定性测试的，对于重要对象较精确的药物敏感性试验还应参考药物专用资料，使用既定性又定量的牛津杯法或打孔法。