蝉花居群形态变异式样

李建平，张 铁，曾文波*

（1.文山学院环境与资源学院，云南 文山 663099；2.文山学院文山州生物资源开发研究中心，云南 文山 663099）

虫草类真菌Cordyceps s.l.感染寄主后形成虫菌复合体，包括大多数虫草、菌菌复合体（如大团囊虫草、头状虫草和分枝虫草等）[1]，以及重寄生（多头霉等可寄生于其他虫草菌上）[2]，虫草类真菌形态独特，昆虫等被真菌感染后僵死，真菌利用寄主体内营养长成子座或孢梗束突出于寄主表面，完整的子实体包括虫体部分（菌核）和一段似草的部分子座（或孢梗束），因此人们形象地将之称为虫草。

“蝉花”（Isaria cicadae）是我国名贵传统中药材，最早关于“蝉花”的记载是成书于公元五世纪的《雷公炮炙论》[3]，现代研究表明，蝉花为真菌Isaria cicadae Miquel感染蝉若虫后形成的虫菌复合体[4]，分布广泛，包括中国、韩国、日本、澳大利亚、新西兰、巴西、南亚、欧洲、北美等国家和地区[4－5]，具有多种药理作用，在我国的药用历史超过1 500年，可作为冬虫夏草的代用品[3－4]，蝉花是具有巨大开发价值的野生资源之一。

目前，关于虫草类真菌的形态特征研究多是关于虫草子座、菌核、子囊结构[6-12]，以及菌丝体形态[4]的描述，关于虫草居群形态学的报道很少，本文以居群为单位，研究蝉花的孢梗束、菌核形态在居群间和居群内及个体间形态变异式样。从形态角度探讨蝉花状变异式样与生态适应特征，揭示其分化特点，为蝉花资源的开发利用提供基础数据。

1 材料和测定方法

1.1 材料

用于观察的材料为新鲜虫草，包括蝉花10个居群共100个个体，冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）5个居群共50个个体，详见表1。

表1 10个居群蝉花和5个居群冬虫夏草来源Tab.1 Locality of 10 populations of Isaria cicadae and 5 populations of Ophiocordyceps sinensis

1.2 形态性状测定方法

采用生物统计方法[13]，每个居群随机选取新鲜样品10个个体，按虫草不同部位（菌核部分，孢梗束或子座部分），分别测量其重量、周长、长、分枝数等性状，其中，重量为样品干燥后测定值，每个性状测量3次，取平均值，所测性状及其对应的编号见表2，其中，由于蝉花孢梗束分枝较多，选取一级分枝最长的3枝测量，对于达不到3枝的个体，缺失分枝长BC和分枝周长BZ两个性状数值记为“0”。

表2 蝉花和冬虫夏草观察性状、编号Tab.2 Number of morphological traits of Isaria cicadae and Ophiocordyceps sinensis

1.3 数据分析方法

1.3.1 形态性状基本统计量

使用SAS 8.1软件计算蝉花和冬虫夏草形态性状的平均值、标准差、最大值、最小值和变异系数。标准差StdDev表示形态性状值在平均值上下波动大小，标准差越大则反映形态性状值离平均值波动越远；变异系数CV（标准差除以平均值）表示表型性状值离散性程度，变异系数越大则表型性状值离散程度越大，反映形态性状值在居群中的整齐性程度[14]。

1.3.2 形态性状巢式方差分析

形态性状巢式等级方差分析[15-18]的模型为：

式中：Yijkl为第i个居群第j个单株第k次重复第l次的观测值；μ为总体平均值；Si为第i个居群的效应（固定）；T(i)j为第i个居群第j个单株的效应（随机）；R(ij)k为第i个居群第j个单株第k次重复的效应（固定）；ε(ijk)l=ε(ijk)=试验误差。

为进一步了解蝉花形态性状在居群间和个体间的分配情况，利用SAS 8.1进行巢式方差分析，使用的SAS程序[18]如下：

1.3.3 形态性状Q-聚类分析

采用AVE聚类法，对10个居群蝉花样品形态性状的平均值进行居群间聚类分析，使用的SAS程序[18]如下：

表3 蝉花与冬虫夏草物种水平形态性状分析结果Tab.3 The analysis results of morphologic traits of Isaria cicadae and Ophiocordyceps sinensis at species level

2 结果与分析

2.1 形态特征基本统计量

变异系数可表示表型性状值离散性的程度，变异系数越大，则性状值离散程度越大，反之则小。蝉花和冬虫夏草物种水平形态性状统计结果见表3。

10个居群的蝉花，其菌核长（JC）平均值在3.18 cm～5.15 cm 之间，居群水平 CV 值为 5.93%～10.56%，物种水平 CV值为 14.91%；菌核周长（ZC）平均值在2.98 cm～4.16 cm之间，居群水平CV值为 6.07%～9.97%，物种水平 CV 值为 12.97%，Pop ICKSG的菌核长和周长最小，Pop ICYTS的菌核长和周长最大，Pop ICYTS的寄主为竹蝉，Pop ICKSG的寄主是鸣鸣蝉，Pop ICWYJ的寄主是云南黑蝉，表明蝉花的菌核长和周长主要是与寄主直接相关的，菌核长和菌核周长这两个形态性状的CV值较小，说明这两个性状稳定，变异不大。蝉花菌核重量（JZ）平均值在 0.20 g～0.95 g 之间，CV 值为 17.35%～36.63%；孢梗束重量 （ZZ）平均值在 0.09 g～0.44 g之间，CV值为13.40%～45.79%，表明不同产地的蝉花的菌核和孢梗束重量有较大的差异。蝉花孢梗束一级分枝数（BR）平均值在1.7枝～3.9枝之间，CV值为38.83%～114.32%，表明蝉花孢梗束多分枝，孢梗束的分枝数变异大。分枝1长（BC－1）平均值在3.05 cm～7.19 cm 之间，分枝 1 周长 （BZ－1）平均值在 1.26 cm～2.31 cm 之间；分枝 2 长 （BC－2）平均值在 1.91 cm～5.36 cm 之间，分枝 2 周长 （BZ－2）平均值在 0.38 cm～0.90 cm 之间；分枝 3 长 （BC－3）平均值在 0.50 cm～2.19 cm 之间，分枝 3周长 （BZ－3）平均值在0.06 cm～0.38 cm之间，蝉花12个形态性状的变异系数（物种水平），分枝3周长（BZ－3）最大，CV值为163.79%，其次为分枝3长度（BC－3），CV值为162.57%，由于个体间分枝数目不一致，使得分枝相关的形态性状变异最大。

除了与孢梗束分枝数相关性状以外，蝉花孢梗束重量的变异系数最大（45.88%）；其次是子实体重量QZ（44.29%）；不同居群内每一表型性状的变异系数均有一定差异，说明蝉花居群间由于遗传和环境异质性导致居群表型变异存在差异。所研究10个蝉花居群的12个形态性状中，与孢梗束分枝数相关的形态性状变异系数值均偏大，说明这些性状在居群内个体间分化较大，多态性丰富，这可能与其适应生长环境有关。

冬虫夏草5个居群8个形态性状的变异系数（物种水平）在16.02%～48.44%之间。这些形态性状中菌核重量的变异系数最大（48.44%），不同产地冬虫夏草的大小和重量等形态性状，主要与冬虫夏草寄主的种类和被感染年龄有关，子座一级分枝数（BR）的变异系数为0，表明该性状较其他性状稳定，冬虫夏草子座多单生。

2.2 巢式方差分析

巢式方差分析可以揭示居群间和居群内的变异，而且可以划分居群间和居群内变异组分。蝉花形态性状的表型分化系数（Vst）见表4。

表4 蝉花10个居群12个性状巢式方差分析Tab.4 Nested variation analysis of 12 morphological traits among 10 populations of Isaria cicadae

从表4可知，蝉花菌核部分12个形态性状在居群间的平均方差分量占33.79%，居群内个体间的平均方差分量占总变异的66.21%，居群内个体是形态性状变异的主要来源。其中，菌核部分3个形态性状在居群间的平均方差分量占69.21%，居群内个体间的平均方差分量占总变异的30.79%，居群间的多态性大于居群内的多态性；蝉花孢梗束部分7个形态性状在居群间的平均方差分量占18.02%，居群内个体间的平均方差分量占总变异的81.98%，居群内的多态性远大于居群间的多态性，与孢梗束分枝等相关的形态性状的差异则主要来自于个体间，同一居群不同个体的孢梗束形态性状差异巨大，孢梗束的生长除受到蝉花本身的遗传因素影响，在生长过程中环境因素的影响较大，这使得居群内个体间的孢梗束形态变异较菌核相关形态性状丰富。

冬虫夏草12个性状中，由于测量个体的分枝数均为1枝，有效的形态性状数据有7个，详见表5。

表5 冬虫夏草5个居群7个性状巢式方差分析Tab.5 Nested variation analysis of 7 morphological traits among 5 populations of Ophiocordyceps sinensis

从表5可以看出，这七个性状均表现为居群间方差分量大于个体间方差分量，表明居群是这些形态性状的主要来源，居群间形态有较大的分化。冬虫夏草形态性状在居群间与居群内的分布式样与蝉花不一样，冬虫夏草形态性状在居群间的分化大于蝉花居群间的分化。

2.3 Q-聚类分析

10个蝉花居群17个形态性状AVE聚类法的谱系聚类图见图1。

图1 10个蝉花居群17个形态性状AVE聚类法的谱系聚类图Fig.1 Q-Cluster of 17 morphological traits assayed in 10 populations of Isaria cicadae with average linkage method

由图1可知，10个居群的蝉花聚成CladeA和CladeB两支，在CladeB中包括9个居群的蝉花，CladeA中包括1个居群（Pop ICKSG）的蝉花。在CladeB中，产自兰坪县的7个居群（Pop ICLHH、I CLHQ、ICLZD、ICLSH、 ICLTL、 ICLHX、ICLTD）先聚成一支，再依次与Pop ICWYJ和Pop ICYTS聚在一起，聚类图在一定程度上与地理呈相关性，表明不同居群的蝉花的形态性状具有地域性特征。

3 讨论

虫草菌核的大小和重量等性状主要是受到寄主大小的影响，蝉花的寄主为同翅目的昆虫蝉，现已报道关于蝉花的寄主蝉共有8种[19]，而冬虫夏草的寄主为蝙蝠蛾，已报道的种类有57种[20]，冬虫夏草寄主的种类远远多于蝉花的寄主，这可能是冬虫夏草形态性状居群间分化大于蝉花的原因之一。另外一个可能的原因是：人们在巨大的经济利益驱动下，对冬虫夏草进行破坏性的采集，导致冬虫夏草居群分布点的范围不断缩小，这阻碍了冬虫夏草居群间的基因交流，使得冬虫夏草居群间分化进一步加大。由于寄主的种类直接决定蝉花和冬虫夏草的菌核大小，与菌核大小直接相关的性状，如菌核长（JC）、菌核周长（ZC）、菌核重量（JZ）等性状的变异要小（CV值较小），但受到不同产地的寄主种类和分化的影响，使得菌核大小直接相关的性状在居群间形成分化。与孢梗束相关的形态性状，如孢梗束一级分枝数（BR）、分枝1长（BC-1）、分枝 2长 （BC-2）、分枝3长（BC-3）、分枝1周长（BZ-1）、分枝3周长（BZ-3）、分枝3周长（BZ-3）则变异较大。同一居群内不同个体的孢梗束差异较大，可能是由于不同的个体在遗传上的差异导致的，在培养蝉棒束孢菌丝体的过程中还发现，不同的菌株在相同的培养条件下，其产孢子、产菌丝、产孢梗束的能力差异明显，表明其在遗传结构上可能具有较大的差异，有必要开展蝉花遗传结构的研究；另外，蝉花孢梗束的形成还受到其生长环境的影响，如菌核距地表的距离、地表的枯枝落叶、地表植被等。总之，遗传上的差异和生境的多样性是蝉花孢梗束形态变异丰富的来源。丰富的变异一定程度上也反映了蝉花具有较强的适应环境能力，这与蝉花分布广、适应性强[4]的实际情况是一致的。

参考文献：

[1]梁宗琦.中国真菌志（第三十二卷虫草属）[M].北京：科学出版社，2007.

[2]王元兵.昆明地区下垂虫草生物学研究[D].昆明：云南大学，2012.

[3]李冰岚.蝉花的本草学考证[J].现代应用药学，1993，10（2）：21-22.

[4]曾文波，常衬心，李建平，等.蝉棒束孢显微形态变异样[J].微生物学报，2017，57（3）：350-362.

[5]曾文波，王元兵，虞泓，等.蝉棒束孢居群分布及生境调查[J].中国食用菌，2015，34（4）：50-56.

[6]刘爱英，梁宗琦.中国虫草属一新记录种[J].真菌学报，1993，12 （3）：248-250.

[7]梁宗琦，刘爱英，刘作易.冬虫夏草子囊孢子的发育[J].真菌学报，1995，14（2）：148-152.

[8]梁宗琦，刘爱英，黄建忠，等.宽阔水自然保护区的虫草及其相关真菌I[J].真菌学报，1996，15（4）：264-271.

[9]梁宗琦，刘爱英，黄建忠，等.宽阔水自然保护区的虫草及其相关真菌II[J].菌物系统，1997，16（1）：61-67.

[10]刘作易.虫草属及其无性型关系研究[D].武汉：华中农业大学，1999.

[11]臧穆.我国热带真菌两新种[J].云南植物研究，2001，23（3）：295-297.

[12]杨钟林，虞泓，陈自宏，等.滇中蛹虫草居群生物学及其生态学习性研究[J].中国食用菌，2011，30（5）：43-47.

[13]杜荣骞.生物统计学[M].北京：高等教育出版社，1990.

[14]高惠璇.实用统计方法与SAS系统[M].北京：北京大学出版社，2001.

[15]葛颂，洪德元，钱迎倩.遗传多样性及其检测方法，生物多样性研究的原理与方法 [M].北京：中国科学技术出版社，1994.

[16]虞泓，黄瑞复.云南松居群核型变异及其分化研究[J].植物分类学报，1998，36（3）：222-231.

[17]虞泓，杨彩云，徐正尧.云南松居群花粉形态多态性[J].云南大学学报：自然科学版，1999，21（2）：86-89.

[18]何显静，王兵益，虞泓.SAS系统在川百合形态变异式样研究中的运用[J].云南大学学报：自然科学版，2003，25（增刊）：75-77.

[19]陈祝安，李增智，陈以平.金蝉花[M].北京：中医古籍出版社，2014.

[20]Wang XL,Yao YJ.Host insect species of Ophiocordyceps sinensis:a review[J].ZooKeys,2011(127):43-59.