敦煌盐碱土中抗黄芪根腐病放线菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

牛世全，赵 丹，豆建涛，豆雅楠，朱学泰

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

黄芪为多年生豆科植物，以根入药，是药用价值很高的中药材.近些年，随着黄芪种植面积的增大，以黄芪根腐病为主的病害问题也日趋严重，制约着黄芪的产量和品质.黄芪根腐病是由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)引起黄芪根部的腐烂病变[1].该病的防治方法以化学防治为主再结合一些农业管理措施，但是农药的长期使用致使病原菌产生耐药性且对生态环境有极大破坏.生物农药因其具有无污染、成本低、不易使病原菌产生抗药性等优点，渐渐受到研究者的重视.目前对黄芪根腐病的生物防治也有了一些研究，如滕艳萍等[2]用木霉制剂抑制黄芪根腐病，发现木霉对病原菌菌丝有消解作用；赵庆芳等[3]采用苦参碱、槐啶碱、槐果碱、对羟基苯甲酸和阿魏酸5种物质对黄芪根腐病进行抑菌性研究，发现槐啶碱和苦参碱混合液对黄芪根腐病具有明显抑制作用.

放线菌广泛存在于自然界中，可产生大量丰富的抗生素.据统计，应用于医药和农业方面的抗生素有70% 产于放线菌[4].近些年，不少研究者又把目光转向了极端环境放线菌的研究[5-8].在高温、高盐、高碱等极端环境中生长的放线菌，拥有独特的生理机制和特殊的基因类型，从而可以产生特殊的活性物质[9].本课题组长期开展河西走廊盐碱土中生防放线菌资源的研究，目前已有一些成果.从石羊河、黑河及疏勒河3大流域盐碱土中分别筛选出对牛无乳链球菌和猪金黄色葡萄球菌、马铃薯干腐病菌、黄芪根腐病菌有生防作用的菌株[10-12]，在张掖和酒泉地区分离筛选到对油菜菌核病、立枯丝核菌抑菌效果显著的菌株[13-14].

本研究从敦煌地区的盐碱土中分离筛选出对黄芪根腐病具有生防作用的菌株，并对生防菌株的发酵条件进行优化，为黄芪根腐病的生物防治提供理论和实践应用支撑.

1 材料与方法

1.1 材料

样品来源：2015年10月从甘肃敦煌地区共采集土样5份(表1).每个样点采用5点取样法，样品采集后于4 ℃低温保存并尽快进行放线菌的分离.

表1 土样基本信息

供试病原菌：黄芪根腐病尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、黄芪根腐病茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、马铃薯茄链格孢菌(Alternariasolani)、油菜立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、苹果树腐烂病菌(V.mali)为本研究室保藏，黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)由甘肃省农业科学院植物保护研究所惠赠.

培养基：A高氏Ⅰ号培养基、B改良脯氨酸培养基[15]、C几丁质培养基[16]、D海藻糖- 脯氨酸培养基[17]、E甘油-门冬酰胺琼脂培养基[18]、PDA培养基、察氏培养基、小米浸液培养基、发酵基础培养基(大豆粉 20 g·L-1,玉米粉 30 g·L-1,NaCl 1 g·L-1,K2HPO41 g·L-1,CaCO33 g·L-1，pH自然).

1.2 拮抗放线菌的分离与筛选

采用稀释涂布法和划线法分离纯化放线菌.将分离到的放线菌与尖孢镰刀菌采用平板对峙法接种于PDA培养基上，28 ℃培养4～7 d后，测量菌落直径，计算抑菌带.

将抑菌带大于30.0 mm的8株放线菌用菌丝生长速率法进行复筛，计算抑菌率[19].

将生防效果显著的放线菌株进行抑菌广谱性测定.以5种病原菌为靶标菌，按初筛、复筛方法测定，用公式(1)和(2)计算抑菌带大小及抑菌率.

1.3 菌株的鉴定

形态学鉴定：采用插片法，28 ℃培养7～14 d后，观察气生菌丝、基内菌丝的生长状况和可溶性色素的产生等形态特征，并在光学显微镜下观察气生和基内菌丝的形状、孢子链的有无及其形状.

培养特征及生理生化特征：根据《链霉菌鉴定手册》及文献[20]提供的方法将待鉴定菌株A12-2-11划线接种于ISP1～ISP5、PDA、察氏培养基等8种培养基上，28 ℃培养7～14 d后记录气生菌丝和基内菌丝的颜色以及可溶性色素的产生.生理生化实验包括明胶液化、牛奶凝固与胨化、黑色素产生等.

分子学鉴定：采用微波法[21]提取DNA，利用放线菌特异性引物S20/A19对菌株16S rDNA基因进行PCR扩增[22].PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至北京奥科生物科技有限公司测序.测序结果用BLAST程序对所得序列与GenBank中已知序列进行比对分析，用MEGA 7.0 软件以邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树.

1.4 发酵条件的优化

不同碳、氮源对发酵滤液抑菌作用的影响：在其他培养条件不变的情况下，分别用麦芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖等量替换基础发酵培养基中的玉米粉；用牛肉膏、酵母粉、KNO3和(NH4)2SO4等量替换基础发酵培养基中的黄豆粉，其他成分不变.按菌丝生长速率法测定，每组设置3个重复，确定培养基最佳碳源和氮源.

正交试验：采用最佳碳源(蔗糖)、最佳氮源((NH4)2SO4)、NaCl和pH共4个因素，设置3个水平，按L9(43)正交表进行正交实验(表2)，以菌丝生长速率法测定，每组重复3次.

正交实验结果论证：用发酵基础培养基和优化培养基按菌丝生长速率法测定抑菌率.

表2 发酵条件正交试验设计

1.5 数据分析处理

利用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 放线菌的分离和对黄芪根腐病具有拮抗作用放线菌的筛选

采用不同培养基从5个土壤样品中共分离得到321株放线菌，其中高氏Ⅰ号培养基分离得到的菌株数最多，共146株.

采用平板对峙法筛选出18株对尖孢镰刀菌有抑菌效果的放线菌，占放线菌总数的5.6%.将抑菌带大于30 mm的放线菌菌株进行菌丝生长速率法测定后，结果显示供试菌株的发酵滤液抑菌率为10.49%～41.77%,其中菌株A12-2-11抑菌效果最强，初筛抑菌带为32.50 mm，发酵滤液抑菌率为41.77%.

菌株A12-2-11的广谱性结果显示，菌株A12-2-11对供试的5种植物病原菌均有一定的抑制作用，其中对黄芪根腐病茄腐镰刀菌抑菌效果最强，抑菌带大小为31.00 mm，发酵滤液抑菌率达到63.41%(表3).

表3 A12-2-11对5种病原真菌的抑制作用

注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.2 菌株A12-2-11的鉴定

采用培养形态与生理生化特征对菌株A12-2-11初步鉴定结果显示，菌株A12-2-11在高氏Ⅰ号培养基上，气生菌丝粉状、前期白色后期黄色，基内菌丝呈黄色，不产生可溶性色素(图1).在其他7种培养基上生长状态不同，气丝与基丝颜色相同或不同，均无可溶性色素产生(表4).

表4 菌株A12-2-11在不同培养基上的培养特征

图1 菌株A12-2-11在高氏1号培养基上的培养形态 及显微形态

菌株A12-2-11不能使纤维素水解，不产生H2S和黑色素，不能使硝酸盐还原；能使明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解；不能利用果糖和肌醇，能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇.

对菌株A12-2-11的16S rDNA序列进行PCR扩增和测序，用MEGA 7以邻接法构建菌株A12-2-11的16S rDNA系统发育树(图2).16S rDNA分子学鉴定结果显示，菌株A12-2-11与黄色长孢链霉菌(Streptomyceslongisporoflavus)相似性达到99%，结合形态学鉴定结果及生理生化反应，参考文献[23]及《链霉菌鉴定手册》将菌株A12-2-11初步鉴定为黄色长孢链霉菌(Streptomyceslongisporoflavus).

2.3 菌株A12-2-11发酵条件的优化

对菌株A12-2-11发酵条件优化结果显示，当碳源为蔗糖时菌株A12-2-11的发酵滤液抑菌活性最强，抑菌率达到50.58%；当(NH4)2SO4为氮源时菌株A12-2-11的发酵滤液抑菌活性最强，抑菌率可达57.53%(图3).

图2 邻接法构建菌株A12-2-11的16S rDNA 系统发育树

图3 不同(a)碳、氮源(b)对菌株A12-2-11 抑菌作用的影响

正交试验结果显示(表5的K值和极差值R)，4因素对菌株A12-2-11的发酵滤液抑菌活性影响顺序为A>D>B>C，最佳水平组合为A2B1C2D3，其中A因素(NH4)2SO4对菌株A12-2-11抑菌率影响显著.因此，确定最佳发酵培养基配方为：蔗糖10 g·L-1，(NH4)2SO410 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，CaCO31 g·L-1，pH 8(表5).正交试验结果表明，菌株A12-2-11经发酵基础培养基发酵培养后，其发酵滤液的抑菌率为42.63%；经优化培养基发酵培养后发酵滤液抑菌率达75.02%(图4，图5).

3 讨论

目前对黄芪根腐病的防治主要以化学农药和栽培管理相结合的方法，如将多菌灵粉剂整地喷洒于地表，及时耙地合理灌溉后，防效可达47%～56%[1].但化学农药的使用导致病原菌产生耐药性，而且使自然环境遭到破坏.因此，生物防治的开发和利用成为了一大研究热点，赵庆芳等[24]研究发现洋葱、小麦、苦豆子等9种植物的水提物对黄芪根腐病菌有抑制作用，可与黄芪轮作来防治该病；马伟[25]等利用蛇床子、知母等中药的提取液制备含药培养基，接种黄芪根腐病菌后发现蛇床子的提取物抑菌率可达到96.13%.利用植物或中药材的提取物对黄芪根腐病进行生物防治，成本较高，在实际应用中有一定的限制.而放线菌作为能够产生大量抗生素的重要微生物资源，由于其无毒、高效、对环境影响小等特点而被广泛开发与应用.因此，利用放线菌代谢产物对黄芪根腐病害进行生物防治是一条较为理想的途径.

表5 正交实验结果

图4 优化培养基与基础培养基对菌株A12-2-11 抑菌作用的影响

a.对照；b.优化前；c.优化后

本研究从敦煌地区盐碱土中分离筛选出一株对黄芪根腐病菌具有生防作用的放线菌株A12-2-11，经形态学鉴定、生理生化及16S rDNA序列分析，初步鉴定为黄色长孢链霉菌(Streptomyceslongisporoflavus).黄色长孢链霉菌在生物防治上的应用已有一些报道，韩立荣等[26]对黄色长孢链霉菌的拮抗作用进行了研究，以15种植物病原菌为靶标菌，发现菌株对所有病原菌均有一定的抑制作用，其中对油菜核病菌抑制作用最明显；刘占良等[27]对黄色长孢链霉菌的抗生素耐药基因进行研究，发现其可以产生耐药基因tnrB23进行替曲那新(Tetronasin)外排作用.

发酵培养是抗生素是否可以进行产业化生产的基础，若是缺乏合理的发酵工业，也就不能将抗生素产生菌的优势充分发挥出来.抗生素产生菌发酵除受营养因素的限制以外,适当的发酵条件也是不可忽视的重要因素[28].本研究采用单因素实验和正交试验相结合的方法对生防菌株A12-2-11进行发酵条件优化，得到最佳培养基.但未考虑实际应用中成本等因素，所以应在此基础上考虑成本及作用的研究，以便推广应用.

4 结束语

本研究从敦煌盐碱土中筛选得到一株对黄芪根腐病具有生防作用的放线菌A12-2-11，经培养条件优化后抑菌率达到75.02%.后续我们计划将此菌株与牛世全等[12]筛选出的黄芪根腐病生防菌制成联合菌剂，对其研制方法和田间黄芪根腐病生物防治作用进行进一步探索.

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