郑州地区正常人群血清炎症细胞因子参考值范围测定

兰 萱，李兆明，张明智

1)郑州大学第一附属医院肿瘤科 郑州 450052 2)河南省淋巴瘤国际合作实验室 郑州 450052

细胞因子是由免疫细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞等)和一些非免疫细胞(内皮细胞、纤维母细胞)经刺激合成的一类具有广泛生物活性的小分子蛋白质，具有调节免疫，促进血细胞生成、细胞生长及损伤组织修复等多种功能。近年来，已有诸多文献[1-5]报道了细胞因子与多种疾病的关系。细胞因子在血液系统及免疫系统疾病的发病、诊断、药物疗效及预后评价方面也发挥着重要作用。现阶段并未见对郑州地区正常人群炎症细胞因子水平的大样本流行病学报道，同时由于临床报道中正常对照样本量小、覆盖范围窄、地域差异及检测技术不同，所报道的结果缺乏可比性，所以建立本地区正常人群细胞因子参考值范围非常重要。流式细胞术微球阵列法(cytometric bead array, CBA)是基于流式细胞仪器检测平台的液相蛋白定量技术，具有快速灵敏、重复性高、样本需求量小的特点，可一次检测多种可溶性蛋白，在细胞因子多水平同步定量检测中表现出巨大的优势。本研究首次采用CBA检测郑州地区100名正常人血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A水平，为确定郑州地区这些因子的正常参考值提供依据，同时也为后续血液及免疫系统疾病的研究奠定基础。

1 对象与方法

1.1研究对象选择经郑州大学第一附属医院体检中心认定的健康，16～77岁，无急、慢性疾病及传染病，无特殊元素接触史的100名受检者作为研究对象。男性44人，女性56人；根据年龄(按周岁计)分为青年组(17～30岁)35人、中年组(31～45岁)29人、中老年组(46～60岁)32人、老年组(61～77岁)4人。

1.2试验设备及试剂FACS CantoTM型流式细胞仪和人Th1/Th2/Th17 CBA检测试剂盒均为美国BD公司产品。

1.3检测方法①样品预处理：使用EDTAK血常规抗凝管采集100名受检者清晨空腹静脉血2 mL。为避免血清中细胞因子分解消耗，要求2 h内处理血标本。1 800 r/min、4 ℃离心10 min，取100 μL上清，分装至1.5 mL EP管中，置于-20 ℃冰箱备用，剩余血清标记后置-80 ℃冰箱保存，以备后期再次检测。②标准品制备：使用分析稀释液溶解标准品，轻柔混匀后静置15 min，连续等比例稀释标准品，得到12,14,18…1256浓度梯度的稀释标准品。分析稀释液为阴性对照。③血清及标准品的处理及孵育：按照每个样本每种捕获微球10 μL的剂量将7种(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A)捕获微球悬液混匀，离心(300g，5 min)弃上清后，使用增强缓冲液重悬微球，每50 μL的标准品或待测样本中加入50 μL捕获微球混合液，同时加入50 μL PE检测抗体，室温条件下避光孵育3 h后，每管用1 mL洗涤缓冲液洗涤，离心弃上清，用300 μL洗涤缓冲液重悬微球，上机检测各细胞因子水平。④流式细胞仪获取检测数据：按相关机型步骤调整并质控流式细胞仪，调试参数后分别检测标准品及样品，导出FCS数据文件，用FACP软件进行分析，绘制标准曲线，精确计算样品中的细胞因子水平。

1.4数据分析应用SPSS 17.0分析检测结果。由于各细胞因子血清水平均呈非正态分布，故计算中位数及四分位数间距；采用Wilcoxon秩和检验比较不同性别及年龄组间各因子水平的差异；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同性别及年龄分布人群血清各炎症细胞因子检测结果比较不同性别及年龄人群7种炎症细胞因子的水平差异均无统计学意义。见表1、2。

2.2正常人血清各炎症因子的参考值范围正常人血清IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IL-17A的参考值范围分别为2.950～4.697、5.723～12.878、6.970～10.829、4.752～6.504、5.760～12.906、4.332～7.216、7.945～10.910 ng/L。

表1 正常人群中男女血清各炎症因子比较 ng/L

表中数据为M(P25，P75)

表2 不同年龄段正常人血清各项炎症因子比较 ng/L

表中数据为M(P25，P75)

3 讨论

血清中各种细胞因子均参与机体生理功能，正常稳定的细胞因子水平是保持人体内环境稳定的重要因素。现阶段检测可溶性因子的常规方法很多，包括Western blot定性检测及ELISA定量检测，但ELISA每次只能检测一种细胞因子，不仅费时费力，而且样本需求量较大，因此适用范围局限。CBA利用一系列荧光强度不同的微球，上面包被特异性捕获抗体，其与待测样本孵育后形成“三明治”复合体，根据软件计算的标准曲线对目的蛋白进行精确定量，操作方便，操作误差小，且样本用量少，一次可进行多种指标检测。本次研究采用CBA对7种炎症细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A)水平进行测定，成功建立了稳定的CBA检测炎症细胞因子体系，为以后深入研究血液细胞因子网络动态变化，探求其在淋巴瘤等疾病的发病机制，诊断监测及治疗预后中的意义提供了坚实的实验及数据基础。

本研究结果中正常人群血清IFN-γ及IL-10水平与山西地区一项研究[6]的报道结果相接近，而其他因子结果之间差异较大，考虑可能与生活环境，饮食习惯等地理因素有关，同时此报道只纳入18名正常对照，样本量较小可能对结果也存在影响。在相关研究中，分别有两篇[7-8]报道儿童群体中炎症细胞因子水平，本研究数据与他们的研究结果存在较大差别，儿童炎症细胞因子水平明显低于成人，因此对于儿童细胞因子的正常参考值仍需进一步搜集大样本检测。此外，两篇文献之间的数据也存在差别，分析原因除了地域差异、样本量小、处理标本误差外，细胞因子在体内含量较低，因此检测过程中可能存在多种因素导致各报道中的正常对照结果相差较大。

根据多篇报道正常对照组细胞因子水平不一致可知，正常人群细胞因子水平受多种因素影响，因此单纯用外省正常值来衡量郑州地区显然是不科学的，所得结论也是不可靠的，因此建立本地区正常人群血清炎症细胞因子参考值范围对深入研究正常机体乃至多种相关疾病与细胞因子的关系意义重大。本次研究表明，正常人群中血清细胞因子水平不受性别及年龄影响，但由于本实验纳入人数有限，结果并不能完全反映年龄及性别因素对正常人群血清炎症细胞因子的影响，还需更加深入广泛的流行病学调查。

此外,机体内细胞因子水平会对免疫应答、血细胞生成、组织损伤修复等起重要作用，而正常人群的炎症细胞因子水平受多种因素影响。所以建议平常生活中应注意培养合理的生活习惯，科学饮食搭配，注意加强体育锻炼增强体质，提高免疫功能，从而使机体血清细胞因子处于合理平衡状态。

[1] 冯毅.噻托溴铵对COPD稳定期患者炎症因子和肺功能的影响[J].临床和实验医学杂志,2015,8(8):633

[2] 蔡伟,张秀伟,张希龙,等.阻塞性睡眠呼吸暂停综合征、炎症因子与动脉粥样硬化间关系的研究进展[J].东南大学学报(医学版),2015,1(1):159

[3] 陈英,张文玲,黄涛,等.炎症因子TNF-α、IL-6、IL-17与类风湿关节炎并发动脉粥样硬化的关系[J].免疫学杂志,2017,3(3):268

[4] 王少鑫,浦江,刘超群,等.炎症因子TNF-α、IL-6和IL-4在溃疡性结肠炎中的表达及临床意义[J].胃肠病学和肝病学杂志,2015,1(1):104

[5] 徐彦立.联合血液净化治疗对重症急性胰腺炎患者炎症因子和疗效的影响[J].重庆医学,2015,18(18):2553

[6] 陈俊伟,张少然,闫成兰,等.T辅助细胞亚型细胞相关因子在类风湿关节炎发病中的作用[J].中国药物与临床,2012,12(4):420

[7] 徐晓军,汤永民,赵宁,等.Th1/Th2细胞因子谱在儿童噬血细胞综合征诊断中的意义[J].中华儿科杂志,2011,49(9):685

[8] TANG Y,XU X,SONG H,et al.Early diagnostic and prognostic significance of a specific Th1/Th2 cytokine pattern in children with haemophagocytic syndrome[J].Br J Haematol,2008,143(1):84