金线莲组织培养技术研究进展

杨成行，李晓婷，袁建振，马 清

(兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020)

金线莲 (Anoectochilusroxburghii)为兰科(Orchidaceae)开唇兰属多年生草本植物，主要分布于福建、浙江、广东、海南、台湾等东南沿海省(区)及贵州、四川、湖南、云南、西藏等内陆地区[1]。金线莲作为珍惜名贵中草药，其药性平和，常用于治疗幼儿发热、急性肾炎等疾病[2-4]，在民间有“金耳环”、“鸟人参”、“金钱草”等美誉[5]；此外，由于金线莲株形小巧优美，叶脉金黄、呈网状排列，常作为高端盆栽，或与兰草(Eupatoriumfortunei)等盆景镶嵌搭配，是名贵的室内观叶、观花盆栽珍品[6]。因此，金线莲具有极高的药用价值与经济价值[2,6]。金线莲属于典型的阴生植物，零星分布于阴蔽阔叶林下肥沃的腐植土中，对生长环境要求严格，自然环境下难以大量繁殖[7]；加之近年来自然环境恶化以及私采滥挖泛滥，导致其野生资源濒临灭绝[8]。目前，利用组织培养技术快繁植株，不仅有利于解决野生金线莲资源紧缺问题，而且对于该物种的种质资源保护也发挥了积极的作用。为此，从外植体的选择、愈伤及芽的诱导、增殖培养等方面对金线莲组织培养快繁体系进行综述，以期为相关科研工作者和生产者提供参考。

1 外植体的培养

1.1 外植体的选择

外植体的选择是影响植物组织培养成功与否的重要因素，不同植物的不同外植体建立组织培养快繁体系难易不同[9-10]。金线莲组织培养外植体材料通常有种子[11]、具节茎段[12-14]、茎尖[14-15]、茎片[16-17]与叶片[14]等，各自经过相应的灭菌方法，建立无菌体系。

1.2 消毒处理

植物组培过程中的三大难题之一即菌类污染，降低污染率是建立植物组织培养快繁体系的前提[18]。兰科植物组织培养常用的外植体消毒试剂有75%酒精、0.1%升汞、次氯酸钠、10%次氯酸钙、饱和漂白粉溶液以及吐温等[19-20]。目前，金线莲组培消毒配合使用75%酒精和0.1%的升汞，能有效降低种子污染率。先加入75%的酒精浸泡30～60 s，用无菌水冲洗3次，再用0.1%的升汞溶液消毒15～20 min，最后用无菌水冲洗5次，可使灭菌率达到100%，且种子萌发生长良好[21-22]。

1.3 基本培养基的选择

基本培养基是植物生长发育的主要能量来源，筛选合适的基本培养基是植物组织培养成功的基础。目前金线莲组培试验使用的基本培养基有MS、1/2MS、N6、B5、VW等[23-24]，其中，MS培养基对于金线莲愈伤组织生长的促进作用优于其他培养基[25]，这可能是由于MS培养基相较于B5培养基含有更全面的营养成分。目前除了较为通用的MS基本培养基外，还有营养成分全减半的1/2MS基本培养基[26]和大量元素减少、微量元素增加的改进配方[16]。

2 金线莲组织培养体系

金线莲组织培养体系的建立一般通过3条途径：一是由外植体脱分化形成愈伤组织，再诱导愈伤组织分化形成不定芽，之后将不定芽进行继代增殖培养使其形成大量丛生芽，最后诱导生芽愈伤组织产生不定根形成新的幼苗[27]；二是诱导带节茎段直接长出腋芽或顶芽，再对其二次继代培养，最后进行生根培养[28]；三是在无菌条件下诱导种子萌发或通过茎尖、茎段等外植体产生原球茎，再由原球茎分化，进而获得完整幼苗[26]。其中，以原球茎和带节茎段出芽两种方式进行增殖凭借耗时短、技术简便的优势成为金线莲大规模快繁的主流[29](表1)。

表1 金线莲组织培养快繁途径Table 1 Tissue culture fast propagation route of Anoectochilus roxburghii

2.1 原球茎分化成芽

金线莲原球茎的诱导与分化不仅与培养基组成相关，还与植株基因型有关[31]。在对金线莲原球茎的增殖进行研究时发现，选择合适的基本培养基能明显促进原球茎的增殖，其中以B5培养基效果最优，且附加一定量的天然有机物也有利于增殖，如加入椰汁培养45 d后原球茎重量平均增加6倍以上[24]。刘丹[26]却发现，MS更适合于金线莲原球茎的分化培养。杨柏云等[30]也认为，MS基本培养基更适合金线莲原球茎的分化培养，并且以金线莲茎段为外植体，添加不同浓度的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)、TDZ(噻苯隆)和S-3307(烯效唑)开展正交试验，寻找原球茎诱导、增殖、分化与生根的最佳培养基及影响原球茎增殖与分化的主要因子，结果发现，在最适激素配比下原球茎的诱导率达93.3%，原球茎增殖的系数达9.4，芽分化率达91.7%，最适培养基为MS+0.4 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1NAA。并且，S-3307是影响金线莲原球茎增殖的主要因子，TDZ是影响原球茎芽分化的关键因子。

研究表明，在相同的培养条件下，不同产地金线莲之间诱导原球茎的结果差异较明显[25]，诱导容易程度以广西金线莲最易，台湾金线莲最难(表2)；此外，同种金线莲的不同外植体诱导原球茎效果同样差异显著(P<0.01)，以茎段作为外植体诱导原球茎，诱导率只有66%，而以成熟种子作为外植体诱导原球茎效果最佳，在90%以上。虽然以种子作为外植体诱导原球茎最易而且产量较多，但以它诱导的原球茎成苗率只有51%[32]。

表2 不同产地金线莲在相同激素浓度下的原球茎和芽的诱导率Table 2 Protocorm and shoot induction rate Anoectochilus roxburghii plants of different origins

2.2 带节茎段诱导丛生芽

对金线莲组织培养与快繁研究表明，与茎片、顶芽作为外植体相比，以金线莲带节茎段为外植体诱导丛生芽效果最佳[13,33]，且以茎段为外植体诱导产生的丛生芽的增殖能力明显优于顶芽产生的丛生芽[17]。

对于带节茎段诱导丛生芽增殖这一途径，刘润东等[34]在添加6-BA 1.0 mg·L-1的MS培养基上，附加低浓度的玉米素(ZT)能明显促进丛生芽的产生。郝丽丽等[35]也认为适量浓度的ZT能显著(P<0.05)促进腋芽的发生与增殖，当添加的玉米素浓度达到0.6 mg·L-1时最有利于芽的增殖。目前对于金线莲带节茎段诱导丛生芽这一途径中6-BA与NAA的作用积极与否尚存争议，但大多倾向于6-BA/NAA在6～10倍范围内与有机物配合使用能有效促进腋芽的诱导与增殖[27,34-38](表3)。李艳冬等[27]发现，6-BA和NAA与有机物香蕉泥搭配使用时可以有效促进腋芽的诱导与增殖。罗晓青等[28]研究发现，6-BA和ZT激素对丛生芽增殖的效果优于KT，增殖系数达4.3。

2.3 通过愈伤组织分化成芽

外植体和激素配比同时作用于金线莲愈伤组织分化过程[16,39]。冯亦平等[16]以金线莲叶和茎片作为外植体诱导愈伤组织，结果表明，茎片诱导效果远好于叶片，并且以MS为基本培养基可形成大量丛生芽，在合适激素配比下诱导率可在60%以上，而以叶片诱导愈伤组织不仅时间长而且诱导率低。也有研究[39]同样证实，以叶片作为外植体几乎不能诱导出愈伤组织，相反茎段和茎片诱导的愈伤组织均能长出大量的不定芽。这表明金线莲叶片难以诱导出愈伤组织，并不适合大规模应用。

研究发现，6-BA较2,4-D、NAA、KT对金线莲以茎段为外植体诱导愈伤组织有明显效果，影响强弱顺序为6-BA>2,4-D>NAA>KT，各激素最佳浓度依次为1.0、2.0、0.5和0.25 mg·L-1，特别是在3.0 mg·L-12,4-D、1.0 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1NAA和 0.25 mg·L-1KT 的激素配比条件下效果最佳[40]。王雅英等[39]采用正交试验进一步发现，6-BA和ZT是诱导金线莲愈伤组织的主要因素，附加适量的KT可明显提高愈伤组织的诱导率，其中，以不定芽作为外植体时，在2.0 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1NAA 和0.2 mg·L-1KT的激素配比条件下的愈伤组织诱导率达95%。以上研究均表明，6-BA在金线莲愈伤组织诱导过程中起关键性作用。

表3 金线莲丛生芽增殖培养基Table 3 Anoectochilus roxburghii bud proliferation medium

研究[30]表明，一定浓度的6-BA和NAA能促进愈伤组织诱导成芽，且当6-BA和NAA浓度比例大于1时效果最为明显。在6-BA和NAA浓度比例大于1的基础上，添加适量的KT能够更好地促进芽的诱导，进而产生丛生芽或原球茎[7]。

2.4 金线莲生根

植物生根受多种因素影响，如激素比例、外源有机物种类与含量等[22]。取茎段粗壮、长势好的金线莲幼芽转移至生根培养基上诱导生根时发现，在激素配比为0.5 mg·L-1NAA、4.0 mg·L-1IBA和0.1 mg·L-16-BA、并附加3 g·L-1活性碳和100 g·L-1香蕉汁的条件下，金线莲的生根率可达97%；虽然添加6-BA对生根时间、生根率及根长有较大的促进作用，但对生根数量影响不大[17]。在NAA使用方面，对福建金线莲的研究中，在培养基中加入3 g·L-1的NAA有利于生根[41]，但同样认为对于金线莲生根数没有显著(P>0.05)影响[42]。此外，添加活性炭有助于根的生长，其中活性炭浓度1 g·L-1时促进作用效果最好，可在保证生根所需营养的同时，获得较好的生根率并能提高根的质量，有利于组培苗移栽[43]。

3 影响金线莲组织培养的其他重要因素

3.1 光照条件的影响

目前关于金线莲组织培养的研究主要集中于培养基配方调整上，在金线莲培养与外部环境相关性方面的研究较少。金线莲属阴生植物，适合在荫蔽环境下生长[44]，因此光照条件是控制其生长发育以及组织培养及人工栽培成功与否的关键环境因素[45-46]。

在兰科植物组织培养早期愈伤诱导过程中，光照强度过大会催化酚类物质氧化形成醌，导致褐化[47-48]。金线莲组培苗的生长发育对环境光照强度同样非常敏感，在较高或较低光照强度下，植株株高、节间长度、叶面积及干鲜重等均会受到影响[46,49]。对金线莲组培苗生长过程中光强对其产生的影响研究结果表明，光强高时不利于其植株生长发育[50]。

此外，光质对于兰科植物兰花的愈伤组织诱导同样有明显的影响，红光/蓝光比例在一定范围内，值越大对愈伤组织的诱导效果越好，并在比例为3∶1时能促进愈伤组织生长[51]。但Tanaka等[52]认为，蓝光能促进兰科植物原球茎的发生。相关研究也表明，光质对于金线莲组培苗生长发育有重要影响[53-55]。在LED光质对金线莲组培苗生长发育、生理变化的影响研究中，分别釆用红、黄、蓝3种LED光对福建产金线莲组培苗生长形态指标以及叶绿素含量、气孔发育的影响进行比对，试验结果显示，红光与黄光处理有利于金线莲组培苗株高增长，但两个处理的植株较为纤细，且植株的叶绿素a和叶绿素b含量较低；蓝光处理下金线莲组培苗生长情况优于其他两种光处理，叶绿素含量较高，且叶面积与对照组相比增长明显[56]。光质虽然能对植物生长产生一定作用，但并不能取代激素对植物的影响，两者更多是一种补偿。

3.2 天然有机物的应用

在兰科植物离体培养中常用的有机物有香蕉泥、土豆泥、椰子汁等[57-58]。它们含有丰富的有机营养物质和生理活性物质，如氨基酸、酶和激素等[59]。这些物质对于植物发育不是必需的，但对于植物组织培养和再生期间细胞和组织的增殖与分化具有明显的促进作用[60]。研究发现，在培养基中添加适量的土豆泥有利于金线莲组培苗高度和茎直径的增长[61](；添加适量的香蕉泥、椰子汁和蛋白胨有利于金线莲组培苗茎和根系的生长，且香蕉泥会提高金线莲增殖倍数[5](表4)。李艳冬等[27]研究同样表明，在培养机中添加20%的香蕉泥和椰子汁能显著促进金线莲组培幼苗生长(P<0.01)。然而，继代增殖培养基中若加入香蕉泥，则接入的茎段很容易烂掉；而在生根培养基中附加适量的香蕉泥，长出的植株则叶子较绿、茎部较粗壮、长势也较好[62](表4)。因此，在金线莲离体培养中可以添加适量的天然有机物，促进植株生长。但需要注意加入天然有机物质的时间，不同阶段加入有机物的效果不同。

表4 促进金线莲组培苗生长的因素Table 4 Factors to promote the growth of the tissue culture seedlings of Anoectochilus roxburghii

4 小结

金线莲自然繁殖效率低并且生长缓慢，因此随着对其需求的日益增大，急需建立高效的金线莲组织培养体系。金线莲作为兰科开唇兰属植物，虽然目前能从其茎段、类原球茎等途径诱导愈伤组织，但花费时间长且诱导成功率低，因此目前金线莲组培主要通过原球茎诱导途径和具结茎段诱导丛生芽途径实现，其中原球茎途径增殖速度快、增殖系数高，是工厂化育苗的主要途径。细胞分裂素和生长素是影响金线莲外植体分化的关键因素，其中6-BA和NAA浓度比例在6～10范围内有利于外植体的分化，且TDZ对于金线莲原球茎的诱导作用大于NAA。这与一些研究结果相同，未分化愈伤组织内源生长素低于已分化出芽的愈伤组织[63]，内源生长素含量升高时，其愈伤组织分化率降低，恰好与内源细胞分裂素相反[64-65]。这表明，植物内源激素含量调控细胞分化和生长的方向与进程，外源激素通过与内源激素平衡调节发挥作用。因此，植物愈伤组织分化是内源与外源激素调节下的生长素降低和细胞分裂素升高的结果。金线莲组培过程中加入有机物不仅对外植体的分化和芽的诱导有促进作用，并且有利于组培苗的生根，但长时间加入香蕉泥等有机物则会导致植物烂根，这与有机物中的活性氧(ROS)消除相关酶有关，相关研究表明，愈伤组织分化以及不定根的诱导都与过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等活性氧消除相关酶有关[66]。并且在植物愈伤组织分化过程中POD、CAT、SOD等ROS消除酶活性逐渐增强[67-69]。活性氧在细胞发育过程中可以穿透细胞膜，对细胞造成损害[70]，不同植物细胞在分化过程中对活性氧抗性强弱不同，加入外源ROS消除相关酶能减少对细胞的损害[71]。但过量的有机物则会导致细胞缺氧，因此金线莲组培过程中应适时适量添加有机物。此外，光照强度和光质对金线莲组培亦有显著影响，其中红光光强在一定范围内与愈伤组织生长呈正比，与原球茎发生呈反比，这可能与光诱导植物形态建成有关。上述研究对解决野生金线莲资源紧缺和该物种的种质资源保护具有积极意义。

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