p-mTOR/p70S6K信号通路在急性出血坏死型胰腺炎炎症反应中的调控作用

黄洋峰，蒋薇

(四川省人民医院，成都 610000)

急性胰腺炎(AP)是由胰腺酶被激活而造成的胰腺及其周围组织自我消化的急性炎症[1]，胆道疾病、过量乙醇摄入、十二指肠液反流、高脂血症等均可导致AP发生，是常见急腹症。AP可分为急性水肿型胰腺炎和急性出血坏死型胰腺炎(ANP)。磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/磷酸化核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)信号通路广泛存在于生物体内，可影响细胞生长、凋亡以及蛋白质合成等，与临床多种疾病有关[2]。目前，国内外对p-mTOR/p70S6K信号通路在ANP发病过程中的作用机制研究较少，2016年2月～2017年6月，本文以大鼠ANP动物模型为基础，通过雷帕霉素药物干扰，观察p-mTOR/p70S6K的生物学功能变化，探求ANP与p-mTOR/p70S6K信号通路之间的关系，寻找ANP的有效治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：SPF级SD雄性大鼠，体质量(200±20)g，6周龄，96只。许可证号：SCXK(川)2015-030，动物和试验场地由成都里来生物科技有限公司提供。药物：牛磺胆酸钠(成都艾科达化学试剂有限公司，CAS号：145-42-6);雷帕霉素(成都艾科达化学试剂有限公司，CAS号：53123-88-9)。主要实验试剂和仪器:ELISA试剂盒：肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)购自上海茁彩生物科技有限公司，TUNEL试剂盒(In situ cell death detection kit-POD法，10279600)购自瑞士Roche公司，mTOR和p70S6K蛋白抗体购自美国Sigma公司。多聚甲醛(AR级)、伊红液(AR级)、苏木素(AR级)均购自珠海贝索生物技术有限公司；全自动生化分析仪(日本Sysmex)，Multlskan酶标仪(赛默飞世尔)，C2500低温离心机(湖南湘仪)，转轮式切片机(德国徕卡)，BMJ-Ⅲ型-099包埋机(中威电子)，PHY-Ⅲ型-U22病理组织漂烘仪(中威电子)。

1.2 动物模型建立及分组 应用Excel的随机函数RAND将96只大鼠随机分为3组，分别为空白对照组、ANP模型组和雷帕霉素组，每组32只。ANP模型组，以0.1 mL/min的速度向胰胆管逆行注射1 mL/kg的5%牛磺胆酸钠诱导建立大鼠ANP模型[3]；雷帕霉素组，以0.1 mL/min的速度向胰胆管逆行注射1 mL/kg的5%牛磺胆酸钠诱导制备大鼠ANP模型后，予0.5 mg/kg雷帕霉素腹腔注射；空白对照组开腹后，翻动十二指肠及胰腺3次，关腹。

1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)及TNF-α、IL-6和IL-10水平的检测 于造模后3、6、12、24 h，每个时间点各组分别取大鼠8只，麻醉后，迅速从心脏采血，静置60 min，置于4 ℃低温离心机，以4 000 r/min、离心15 min，采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清AMY水平；按照ELISA试剂盒说明书操作，检测不同时间大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.4 胰腺组织p70S6K和p-mTOR蛋白的检测 将上述采血完毕的大鼠，解剖后，取每只大鼠的胰腺组织。于造模后3、6、12、24 h,采用Western blotting法检测各组大鼠胰腺组织中p70S6K和p-mTOR蛋白表达水平。用凝胶图像分析成像系统进行扫描分析，结果以目的蛋白相对表达量表示。目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值(IOD)/内参积分光密度值(IOD)。

1.5 组织病理学的观察 将已固定的造模后24 h的大鼠胰腺组织，经乙醇梯度脱水后，再透明、石蜡包埋、切片，HE染色后，光镜(400倍)下观察组织病变。同时制备保存未经HE染色的石蜡切片，用于后续TUNEL检测。

1.6 胰腺细胞凋亡指数(AI)的检测 采用TUNEL法。取“1.5”中制备好的待用石蜡切片，经脱蜡水化后，按照TUNEL试剂盒操作说明，检测胰腺细胞凋亡情况。每个标本切片随机观察10个高倍镜(×200)视野，计算出细胞AI，AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%，取平均数。

2 结果

2.1 各组不同时间血清AMY及血清炎症因子水平比较 与ANP模型组比较，各时间点雷帕霉素组大鼠血清AMY水平低(P均<0.05)；血清TNF-α水平除了在造模后12 h差异无统计学意义(P>0.05)外，其余时间点均低(P均<0.05)；各时间点血清IL-6均低(P均<0.05)；大鼠血清IL-10高(P<0.01)。空白对照组与雷帕霉素组不同时间比较，P均<0.05。见表1。

2.2 胰腺组织p70S6K与p-mTOR蛋白表达比较 不同时间点，各组大鼠胰腺组织p70S6K与p-mTOR蛋白的表达情况见表2。不同时间点，均可观察到大小约为70 kD的p70S6K蛋白条带和大小约为289 kD的p-mTOR蛋白条带。ANP模型组的p70S6K与p-mTOR蛋白表达均高于空白对照组(P均<0.01)，雷帕霉素组该两种蛋白表达均低于ANP模型组(P均<0.01)，但仍高于空白对照组(P均<0.05)。

表1 各组不同时间血清AMY及炎症因子水平比较

表2 各组不同时间点大鼠胰腺组织中p70S6K与p-mTOR蛋白表达比较

2.3 胰腺组织病理变化 空白对照组胰腺组织无坏死性改变；ANP模型组胰腺组织呈出血性坏死改变，胰腺间质有明显水肿，大量的炎性细胞浸润，可见斑片状出血灶；雷帕霉素组胰腺组织呈水肿性改变，胰腺间质轻微水肿，少量的炎性细胞浸润，未见出血灶，雷帕霉素组胰腺组织病变程度较轻。

2.4 各组胰腺细胞AI比较 造模后24 h，空白对照组、ANP模型组、雷帕霉素组AI分别为1.04±0.43、13.91±1.76、7.19±1.57。与空白对照组比较，ANP模型组、雷帕霉素组AI均高；与ANP模型组比较，雷帕霉素组低(P均<0.01)。

3 讨论

ANP是一种常见的急腹症，伴随全身性的炎症反应。在这个炎症反应的过程中，会激活大量胰酶，如胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶等[4]。当这些胰酶大量释放后，会产生自身消化作用，伤及胰腺和胰腺旁组织，甚至导致组织坏死。组织坏死后，机体进一步释放大量甚至过量的炎性介质，从而引起全身剧烈的炎性反应，因此胰酶自身消化以及先后激化的炎性反应也是ANP的病理基础。

AMY可由胰腺泡细胞分泌，一般存在于胰腺泡细胞内，当胰腺组织遭受致病因子侵袭，这些酶会大量释放。临床上的AP患者大多伴有血清AMY升高，AMY水平也常作为AP诊断及病情评估的重要指标之一[5]。本实验中，AMY检测结果表明，造模后ANP模型组大鼠血清AMY水平一直持续升高，经雷帕霉素干预后，尽管AMY在24 h内，依然呈现持续升高趋势，但与ANP模型组比较，从造模后6 h开始，大鼠血清中AMY水平降低。

TNF-α和IL-6都属于促炎性细胞因子。TNF-α能集聚并直接调节中性粒细胞和嗜酸性细胞，使全身的代谢和各种类型的细胞免疫反应紊乱，产生细胞毒性，影响细胞分裂、分化的正常进行[6]。IL-6主要由单核/巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞等分泌，是一种急性反应性蛋白，能诱导急性期炎性反应的产生，促进并调节炎症反应中多种细胞的分裂、分化[7]。在发生急性炎症时，TNF-α和IL-6水平均会升高。血清TNF-α和IL-6检测结果表明，ANP模型组和雷帕霉素组大鼠血清TNF-α和IL-6水平均在12 h内连续升高，直至第24 h开始出现下降。但经雷帕霉素干预后，大鼠血清TNF-α水平除了在造模后12 h，其余时间点，雷帕霉素组TNF-α水平均低于ANP模型组；大鼠血清IL-6水平从造模后3 h开始，直至造模后24 h，雷帕霉素组均低于ANP模型组。血清IL-10具有多效性和两面性，既能免疫促进，也能免疫抑制。其促进作用主要体现在能促进B细胞的增殖、分化；抑制作用主要体现在对单核/巨噬细胞的抑制[8]。对巨噬细胞，IL-10可以抑制其致炎性细胞因子的释放，抑制活性氧中间体的产生；对于单核巨噬细胞，可抑制相关的NK细胞，抑制IFN-γ和TNF-α合成，这些炎性介质的释放量，也反映了炎症严重程度。本实验中，ANP模型组大鼠血清IL-10水平呈现先增高后降低的变化趋势，造模后6 h达到峰值，此后逐渐降低，而雷帕霉素组大鼠血清IL-10从造模后3 h开始，直至末次检测的24 h，一直持续升高。与ANP模型组比较，从造模后3 h检测开始，直至24 h，雷帕霉素组IL-10水平均高于ANP模型组。推测当IL-10大量释放时，抑制了单核/巨噬细胞对TNF-α和IL-6的合成，TNF-α和IL-6的水平均降低，从而减轻了炎症反应。组织病理学检测结果表明，ANP模型大鼠经雷帕霉素干预后，胰腺组织病变程度减轻，症状得以改善。

mTOR属于磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族成员，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR可调控细胞凋亡、参与核糖体合成、蛋白质翻译等细胞功能。p-mTOR是mTOR的磷酸化状态，其水平高低反映了mTOR活化状态，是mTOR信号通路被激活的重要生物学标志。p70S6K是核糖体40s小亚基S6蛋白激酶，在mTOR信号通路中，p70S6K是一个重要的分子，协调控制细胞增殖与分化，p70S6K可被p-mTOR激活，进而启动翻译过程从而控制细胞的多种病理生理过程。研究报道，p-mTOR/p70S6K与乳腺癌、血管瘤、消化系统肿瘤等密切相关[9]，但与ANP的相关性报道较少。本研究中，从造模后3、6、12、24 h的各组大鼠胰腺组织中均检测到了p70S6K与p-mTOR蛋白表达，相对分子质量大小分别为70、289 kD。表明大鼠在患ANP时，mTOR被激活。当ANP大鼠经雷帕霉素干预后，雷帕霉素组的p-mTOR和p70S6K蛋白表达均低于ANP模型组。mTOR包括mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)[10]。mTORC1由mTOR、mLST8及raptor组成，能感受生长因子、能量状态、氨基酸信号、氧浓度等，以此调节某些与细胞生长代谢相关的过程，而mTORC2由mTOR、mLST8及rictor组成，能被生长因子激活以调节细胞生存、代谢及细胞骨架形成[11]。在ANP的病程中，当炎性介质大量释放导致炎症反应加剧时，胰腺局部受到的炎症刺激或者缺氧时，PI3K/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路被激活，mTORC2可激活Akt，Akt又影响mTORC1活性部分，共同发挥生物学功能[12]。mTOR磷酸化后，可进一步激活其下游分子p70S6K，启动p70S6K的磷酸化状态。p70S6K的激活，促进了细胞的增殖和分化，而增殖分化出的细胞继续被炎症因子侵蚀，释放出更多炎性因子，形成一个恶性循环[13]。该循环内，mTOR信号通路为关键。本研究采用TUNEL法检测了胰腺细胞凋亡情况，结果表明，雷帕霉素组大鼠胰腺细胞AI与ANP模型组相比降低。结合本实验炎性因子水平变化、p70S6K和p-mTOR蛋白表达结果以及细胞凋亡结果，推测其调控机制可能是因雷帕霉素能特异性地结合mTOR，从而抑制mTORC1的活性，并调节其下游活性分子p70S6K的水平，降低通路活性，抑制胰腺细胞增殖分化，抑制了炎症反应，减少了炎症因子的释放，有效减轻胰腺组织病变程度。

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