脑去细胞生物支架的制备与鉴定

郑方平 毛凯丽 赵应征

1(衢州市人民医院药剂科，浙江 衢州 324000)2(温州医科大学药学院，浙江 温州 325025)

引言

近年来，多样化的天然生物材料在再生医学和药物递送系统领域中发挥着越来越大的作用，为转化医学的发展奠定了重要的基础[1-2]。

目前，由动物组织去细胞制备而成的三维组织细胞外基质(extracellular matrix，ECM)已被用于组织工程的研究[1,3-4]。ECM是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质组成。ECM通过高度组织有序的细胞外微环境构成复杂的网架，连接组织结构，在细胞的生存、发育等细胞生理活动中起到关键的调节作用，ECM的支架基底和支架材料是组织工程研究的理想载体。与合成的高分子生物材料相比，天然的ECM生物材料在再生医学应用中具有许多固有的优势：一方面，由于ECM成分在不同的物种之间具有高度保守性，保留了大部分胶原蛋白、弹性纤维连接蛋白、蛋白聚糖等成分，所以具有良好的生物相容性及低免疫原性；另一方面，去细胞化得到的ECM材料有显著的机械强度，保留的多孔网络支架结构可被用于大分子制剂的缓控释新型生物材料。

诸多的研究表明，不同组织的ECM其基质成分组成不同，如脑、脊髓、肝脏及膀胱的ECM成分存在明显差异，因此对去细胞后的组织ECM进行成分的鉴定就显得尤为重要[5]。然而，对脑组织去细胞的研究报道甚少，本实验主要采用优化法制备脑去细胞外基质，并对其组分进行鉴定，进而为脑去细胞外基质(dBECM)的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

Sprague Dawley成年大鼠(SD大鼠，雌雄不限)，20只，体重300～400 g，温州医科大学实验动物中心。

1.1.2试剂

水合氯醛(上海国药化学试剂有限公司)，脱氧胆酸钠(北京索莱宝科技有限公司)，过氧乙酸(北京索莱宝科技有限公司)，TritonX-100(阿拉丁，中国)，SDS(阿拉丁，中国)，H2O2(阿拉丁，中国)，fibronectin(Abcam，英国)，elastin(Abcam，英国)，laminin(Abcam，英国)，collagen IV(Abcam，英国)，牛血清蛋白(BSA，Life公司，美国)，PBS缓冲液(Solarbio公司，中国)，枸橼酸缓冲液(无锡傲锐东源生物科技有限公司)。

1.1.3仪器

BMJ-Ⅲ型病理组织包埋机(常州中威电子仪器有限公司)，旋转型石蜡切片机(英国珊顿公司)，PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪(常州中威医疗仪器有限公司)，ECLIPSE NI正置荧光显微镜(尼康公司，日本)，扫描电镜(Hitachi, H-7500, 日本)。

1.2 方法

1.2.1脑去细胞生物支架的制备

1)灌注法。取成年SD大鼠，称重，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)，打开腹腔，从心尖插入灌流针直至主动脉，剪开右心耳，插入聚乙烯管，腹主动脉不结扎，打开恒流泵以10 mL/min的速度开始从心脏灌注，依次灌注500 mL的肝素化PBS(0.01 mmoL/L)、500 mL的胰酶(0.2 g/L的EDTA)、2 L的1% TritonX-100、2 L的l% SDS，然后再灌注1 L的PBS冲洗残余的试剂。其中，1%的TritonX-100用于破损细胞膜，1%的SDS用于有效去除细胞成分，两者均为较温和的洗涤剂，对细胞外基质的破坏程度小。灌注后的大鼠取脑，并用0.01%的过氧乙酸清洗24 h，清除所有细胞碎片和化学残渣，置于含1%的青霉素/链霉素的4℃无菌PBS溶液中杀菌保存。

2)化学萃取加震荡法。取成年SD大鼠称重，10%的水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，打开腹腔，在室温和无菌条件下，经左心室用生理盐水灌注后，取出大鼠脑组织，保存在4℃无菌蒸馏水中，而后用化学提取法进行脑组织去细胞化。脑组织依次经过3%的TritionX-100室温震荡萃取12 h，无菌蒸馏水漂洗3次/10 min，1%的SDS室温震荡萃取12 h，无菌蒸馏水漂洗3次/10 min，4%的脱氧胆酸钠室温震荡萃取24 h，无菌蒸馏水漂洗3次/10 min，再重复上述萃取过程1次。摇床震荡速度为120 r/min(80 r/min为对照速度)。萃取后的脑组织经0.01%的过氧乙酸冲洗后，置4℃无菌PBS溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)中保存。

1.2.2去细胞程度的检测

通过HE染色和DAPI荧光染核，对去细胞化程度进行检测。

1)大体观察。观察正常脑组织和通过不同方法制备的脑去细胞生物支架的颜色及形态变化。

2)HE染色观察。正常对照组及去细胞组的脑组织经4%的多聚甲醛固定，酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片，常规HE染色后光镜下观察。

3)免疫荧光染色观察：分别制备正常对照组及去细胞组脑组织的石蜡切片，DAPI免疫荧光染色检测两组脑组织细胞核。

1.2.3脑去细胞生物支架结构的完整性

为了观察去细胞后脑组织ECM结构的完整性，用标准冷冻干燥程序冻干脑组织ECM，并在真空干燥器中进一步干燥2 h。将干燥的ECM样品进行横切和镀金，再通过SEM观察它们的表面形态。作为对照，正常脑组织样品通过相同的步骤处理，并进行SEM成像观察。

1.2.4脑去细胞生物支架的成分检测

通过Masson染色，检测其胶原纤维的表达；通过免疫荧光染色，检测纤维连接蛋白(fibronectin)、弹性蛋白(elastin)、层粘连蛋白(laminin)、IV型胶原(collagen IV)的表达。荧光显微镜下观察，细胞核呈蓝色荧光，细胞外基质主要蛋白成分免疫荧光染色出现绿色荧光为阳性表达。

1.2.5脑去细胞生物支架中蛋白成分的定量检测

通过ELISA分析残留蛋白含量。

1)BCA法测定总蛋白含量。根据质量体积比，组织中加入适量的IP细胞裂解液(以体积比为100 mg:1 mL加入PMSF)，在冰浴放置30 min后磁珠裂解匀浆。裂解完全后，以超速冷冻离心机12 000 r/min离心20 min，取上清液；若离心后上清仍浑浊，可再次离心，确保提取的液体澄清。

根据样品数量，按50∶1的体积比加入BCA工作液(BCA试剂A与BCA试剂B混合)配成备用，充分摇匀。再以BCA试剂盒标准操作规程配制标准品标准曲线，将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的标准品孔中，用于PBS补足到20 μL，再将样品加入96孔板。各孔加入200 μL的BCA工作液，37 ℃恒温箱孵育30 min。使用酶标仪测定波长562下的吸收值。

2)用特异性ELISA检测试剂盒，分别检测胶原蛋白collagen IV、纤维连接蛋白fibronectin、弹性蛋白elastin和层粘连蛋白laminin，具体操作步骤如下：

步骤1，加样。每孔各加入标准品或待测的样品100 μL，将反应板充分混匀后置于37 ℃恒温箱内孵育40 min。

步骤2,洗板。用洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上吸干。

步骤3，每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL(空白除外)。将板充分混匀后放置于恒温箱(37℃)，孵育20 min；洗板，同上。

步骤4，每孔加酶标抗体工作液100 μL，将板充分混匀后放置于恒温箱(37℃)，10 min；洗板，同上。

步骤5，每孔加入底物工作液100 μL，置37℃避光反应15 min。

步骤6，所有孔分别加100 μL终止液，混匀。

步骤7，30 min内酶标仪在450 nm处测吸光值。

1.2.6统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，正态分布的计量数据以(x±s)表示。

2 结果

2.1 不同方法制备的脑去细胞生物支架

不同去细胞化方法制备得到的脑去细胞生物支架有所不同。如图1所示，正常对照组脑组织结构致密，用灌注法制备得到的脑去细胞生物支架历经16 h仍未达到去细胞化的状态，脑组织保留了大部分的脑实质，仅出现部分软化显现，呈现完整的脑部结构。而化学萃取加震荡法(120 r/min的转速条件)制备得到的脑去细胞生物支架出现明显的网络结构，呈脑部三维结构和完全去细胞化状态，在相同溶剂处理条件下，80 r/min的转速制备得到的脑细胞外基质去细胞化不完全，有一部分未被去细胞化。

图1 不同方法制备得到的大鼠脑组织去细胞支架。 (a)正常脑组织；(b)灌注法得到的脑去细胞支架；(c)化学萃取加震荡法得到的脑去细胞支架

2.2 脑去细胞程度的评价

HE染色显示，正常对照组的脑组织结构致密，细胞结构完整，细胞核清晰，可见大量星形胶质细胞和脑神经细胞；去细胞组脑组织仅可见网络状结构，去细胞支架上未见残存细胞及细胞核等结构，见图2(a)、(b)。DAPI荧光染色结果发现，正常对照组脑组织DAPI荧光显示蓝色胞核清晰；去细胞组未见明显DAPI与细胞核结合后发出的蓝色强荧光，进一步说明经化学提取法制得的脑去细胞外基质基本无细胞，见图2(c)、(d)。

图2 脑去细胞程度的评价。(a)正常对照组HE染色；(b)去细胞组HE染色；(c)正常对照组DAPI免疫荧光染色；(d)去细胞组DAPI免疫荧光染色

2.3 扫描电镜结果

在扫描电镜下，正常对照组的脑组织可观察到组织结构致密，有星型胶质细胞、神经元细胞、神经纤维和神经超微结构等细胞结构。去细胞组的细胞结构完全消失，整个视野由纤维连接蛋白等细胞外基质构成不规则圆形空腔网络结构，无细胞残留，如图3所示。

图3 扫描电镜图。(a)正常脑组织的扫描电镜图；(b)脑去细胞支架的扫描电镜图

2.4 Masson染色结果

从Masson染色结果可以看出正常对照组中黑蓝色的胞核，以及红色的肌纤维、胞浆和神经胶质等成分，而去细胞组明显观察到大量胶原纤维的保留(呈蓝色)，仅存少量的肌纤维，如图4所示。

图4 Masson染色图。(a)正常脑组织的Masson染色结果；(b)脑去细胞支架的Masson染色结果

2.5 免疫荧光染色结果

去细胞组脑支架经免疫荧光染色，层粘连蛋白(LN)、IV型胶原蛋白及纤维连接蛋白(FN)和弹性蛋白(EN)均呈阳性反应，主要表达于神经纤维基质及ECM中。对照组LN、IV型胶原、FN及EN染色较弱，且阳性表达面积较少，细胞密集，DAPI荧光显示蓝色胞核清晰；去细胞组均可见大面积绿染区域，呈网状结构，未见DAPI与细胞核结合后发出的蓝色强荧光(见图5)，说明经化学萃取加震荡法制备的脑细胞外基质含有大量的纤维连接蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白以及胶原蛋白。此外，通过分析重要的蛋白在dBECM总蛋白中的含量(见图6)，结果发现：层粘连蛋白含量较高，为19%±1.6%；IV型胶原蛋白含量约为16%±1.9%；纤维连接蛋白含量次之，为9%±2.1%；而弹性蛋白较上述3种蛋白含量最少，为4%±1.1%。

3 讨论

图5 脑去细胞支架的成分保留。(a)去细胞组FN免疫荧光染色呈阳性，无细胞核；(b)去细胞组LN蛋白免疫荧光染色呈阳性，无细胞核；(c)去细胞组IV型胶原蛋白免疫荧光染色呈阳性，无细胞核；(d)去细胞组EN蛋白荧光染色呈阳性，无细胞核；(e)正常组FN免疫荧光染色呈阳性，细胞核显蓝色；(f)正常组LN蛋白免疫荧光染色呈阳性，细胞核显蓝色；(g)正常组IV型胶原蛋白免疫荧光染色呈阳性，细胞核显蓝色；(h)正常组EN蛋白免疫荧光染色呈阳性，细胞核显蓝色

图6 层粘连蛋白(LN)、IV型胶原蛋白、纤维连接蛋白(FN)和弹性蛋白(EN)分别在脑去细胞外基质中的相对表达量

组织和器官的去细胞方法是一种成功的技术平台，能为组织工程、再生医学和药物递送领域制备出较好的生物支架材料[6]。各种去细胞方法直接影响着ECM的组分、力学性能以及移植后的宿主反应，也就决定着支架材料在体内外的应用效果。通常，应该尽可能地采用最温和的去细胞方案来达到最佳的去细胞效果，要求这种方法对去细胞后ECM支架的结构和功能成分的破坏程度是最小的[7]。相对于肾、肺、心等其他组织的去细胞技术，脑组织有其特殊性，因此采用的去细胞技术也有别于其他组织。本实验结果表明，经心室灌流法制备的脑去细胞生物支架因血脑屏障等诸多因素，会大大降低灌流的效率，影响去细胞的效果；而化学萃取加震荡法制备的脑去细胞生物支架去细胞化完全，形态保留完整，适合用于脑组织的去细胞化。任何去细胞方法都不可能百分百地将组织器官中所有的细胞成分去除干净，因此只要有一种方法能够清除绝大部分可见细胞成分，那么经过这种方法处理后得到的ECM生物支架可安全地应用在体内研究中。

随着组织工程的发展，从不同组织获得的细胞外基质，包括皮肤、血管、神经、骨骼、肌腱、小肠黏膜下层、膀胱、心脏瓣膜等，已经在可再生材料应用中做了广泛研究[8-9]。然而，对脑细胞外基质的研究报道很少。有研究表明，脑ECM和其他组织ECM(脊髓或膀胱)的组成之间存在明显差异，对脑组织去细胞后得到的ECM进行成分的检测是非常有必要的[10]。IV型胶原和层粘连蛋白共同构成基膜，刺激细胞的黏附和运动，是维持支架三维结构的重要组成分；纤维连接蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展；弹性蛋白可赋予支架伸缩性和可逆的变形能力，这些蛋白对支架的应用都发挥着重要的作用。本实验通过Masson染色观察脑ECM中胞质成分，结果发现脑ECM中存在胶原纤维和肌纤维，胶原纤维表达丰富，肌纤维表达较少。进一步通过免疫荧光染色检测特异的胞内蛋白成分，结果表明脑ECM保留的主要成分是IV型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等细胞外基质成分。这些蛋白成分通过比例排列成空间构象，为种子细胞生长发育提供依附和支撑保障，是维持组织结构与功能的基础，也是细胞重要的信号调节分子，能调控细胞的生长、代谢与分化，使脑ECM在组织修复工程中发挥着重要作用。

脑细胞外基质(dBECM)不仅作为一种良好的生物支架用于脑组织修复，而且越来越多的研究应用dBECM固有的三维超微结构作为小分子化疗剂或大分子治疗剂的缓释载体，模拟合成的生物支架螯合生长因子，以持续释放一些治疗剂，从而实现相关疾病的高效治疗[11]。如在帕金森疾病的治疗中，用dBECM作为大分子蛋白bFGF的载体，从而增强神经保护的作用，以及药物对帕金森的治疗效果[12]。此外，有研究证明，携载纳米粒的ECM给药体系也可以增强多西紫杉醇对脑胶质瘤的治疗效果[13]。这些新型的应用打破已有的支架/移植材料的局限，为dBECM的应用开拓新的领域。

本研究制备的全脑去细胞支架完全地去除脑组织细胞及细胞核结构，同时较完整地保留ECM主要成分(弹性蛋白、LN、IV型胶原等)，简便快捷且成本较低，是一种较理想的脑去细胞生物支架材料的方法。该材料具有良好的生物相容性、低免疫原性、生物活性和三维立体网络结构，有望成为脑部疾病治疗的优良材料，为药物的新型应用提供支撑平台。

4 结论

本研究通过化学萃取加震荡法制备脑去细胞支架，相对于其他方法制备去细胞支架，不仅有效去除细胞，保留营养成分，消除免疫原性，而且最大程度地保存了组织的三维网络结构，这给脑去细胞支架的应用带来新的机遇,具有良好的应用前景。

[1] Wang Xiaoyan, Yu Tailong, Chen Guanghua, et al. Preparation and characterization of a chitosan/gelatin/extracellular matrix scaffold and its application in tissue engineering [J]. Tissue Engineering, 2017, 23(3): 169-179.

[2] Xu Helin, Tian Furong, Lu Cuitao, et al. Thermo-sensitive hydrogels combined with decellularised matrix deliver bFGF for the functional recovery of rats after a spinal cord injury [J]. Scientific Reports, 2016, 6: 38332.

[3] Wang RM, Johnson TD, He Jingjin, et al. Humanized mouse model for assessing the human immune response to xenogeneic and allogeneic decellularized biomaterials [J]. Biomaterials, 2017, 129: 98-110.

[4] Hill RC, Calle EA, Dzieciatkowska M, et al. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering [J]. Molecular & Cellular Proteomics: MCP, 2015, 14(4): 961-973.

[5] Haykal S, Soleas JP, Salna M, et al. Evaluation of the structural integrity and extracellular matrix components of tracheal allografts following cyclical decellularization techniques: comparison of three protocols [J]. Tissue Engineering. Part C, Methods, 2012, 18(8): 614-623.

[6] Baiguera S, Del Gaudio C, Lucatelli E, et al. Electrospun gelatin scaffolds incorporating rat decellularized brain extracellular matrix for neural tissue engineering [J]. Biomaterials, 2014, 35(4): 1205-1214.

[7] Keane TJ, Swinehart IT, Badylak SF, Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance [J]. Methods (San Diego, Calif.), 2015, 84: 25-34.

[8] Yi Sheng, Ding Fei, Gong L, et al. Extracellular matrix scaffolds for tissue engineering and regenerative medicine [J]. Current Stem Cell Research & Therapy, 2017,12(3): 233-246.

[9] Polanco TO, Xylas J, Lantis JC, et al. Extracellular matrices (ECM) for tissue repair [J]. Surgical Technology International, 2016, 28: 43-57.

[10] Vigier S, Gagnon H, Bourgade K, et al. Composition and organization of the pancreatic extracellular matrix by combined methods of immunohistochemistry, proteomics and scanning electron microscopy [J]. Current Research in Translational Medicine, 2017, 65(1): 31-39.

[11] Almeida HV, Liu Y, Cunniffe GM, et al. Controlled release of transforming growth factor-beta3 from cartilage-extra-cellular-matrix-derived scaffolds to promote chondrogenesis of human-joint-tissue-derived stem cells [J]. Acta Biomaterialia, 2014, 10(10): 4400-4409.

[12] Lin Qian, Wong HL, Tian Furong, et al. Enhanced neuroprotection with decellularized brain extracellular matrix containing bFGF after intracerebral transplantation in Parkinson′s disease rat model [J]. International Journal of Pharmaceutics, 2017, 517(1-2): 383-394.

[13] Xu Helin, Mao Kaili, Lu Cuitao, et al. An injectable acellular matrix scaffold with absorbable permeable nanoparticles improves the therapeutic effects of docetaxel on glioblastoma [J]. Biomaterials, 2016, 107: 44-60.