不同剂量人参皂甙Rb1对大鼠脊髓缺血再灌注损伤及survivin的作用

程斌，宋焕瑾，李锋涛，林磊，薛建利，吴昊，叶劲涛

1.西安交通大学医学院第二附属医院骨科，陕西西安市710004；2.汉中市中心医院骨科，陕西汉中市723000

在早期研究中，人们认为缺血是组织损伤、坏死的主要原因，但随着研究深入，发现在缺血一段时间后，如果组织供血恢复，该组织的损伤程度与单纯缺血相比更为严重，此即组织的缺血再灌注损伤。多种原因可以导致脊髓缺血再灌注损伤，如脊柱创伤、血管外科手术等。

大多数研究认为，神经组织缺血再灌注损伤没有有效治疗方法，目前主要使用大剂量糖皮质激素和神经营养药物等治疗[1]。对脊髓缺血再灌注损伤机制的研究集中在炎症损伤、氧化应激、自由基损伤、兴奋性中毒、能量物质缺乏及细胞凋亡等方面，目前认为细胞凋亡是造成损伤的主要机制[2]。

凋亡是重要的生理过程，在促凋亡机制及抗凋亡机制之间存在精确的平衡。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)作为抗凋亡蛋白家族成员，可以抑制caspase凋亡信号途径，在许多物种的凋亡调控中起重要作用[3]。人类的8种凋亡抑制蛋白已被广泛研究，其中survivin可以抑制procaspase-3/procaspase-7或caspase-3/caspase-7的活性，抑制凋亡[4]。

人参皂甙Rb1属于人参二醇，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等作用[5]。本研究探索survivin蛋白和脊髓缺血再灌注损伤之间的关系，以及不同剂量人参皂甙Rb1治疗脊髓缺血再灌注损伤的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

清洁级成年健康Sprague-Dawley大鼠，体质量(213±15)g，购于西安交通大学医学院实验动物中心。

将实验动物分为假手术组、模型组和药物D10、D20、D40、D80组，药物各组剂量分别为10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每组12只。

1.2 主要仪器及试剂

TUNEL试剂盒：南京建成生物工程研究所。survivin单克隆抗体：美国SANTA CRUZ公司。SP免疫组化试剂盒、DAB试剂：北京博奥森生物技术有限公司。多聚甲醛：天津化学试剂厂。人参皂甙Rb1粉剂：中国药品生物制品检定所。HE染液：温州康泰生物科技有限公司。苯巴比妥钠粉剂：美国SIGMA公司。

1.3 造模方法

动物术前禁食一夜，自由饮水。3%苯巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。动物置于恒温毯上，肛温探头置入肛门，保持大鼠体温37.1～37.5℃。颈正中切口，显露左颈总动脉，置入PE50导管并连接于放血装置及监护仪，监测近端动脉压及心率；在大鼠尾中段上1/3显露尾动脉，置入PE50导管并连接监护仪，监测远端动脉压。左腹股沟切口，显露左股动脉，远端结扎后轻微牵拉，近端剪一切口，将Fogarty导管经股动脉置入至胸主动脉高度，立即给予200 U肝素钠，用注射器推入生理盐水0.05 ml，避免球囊松弛。立即打开放血装置放血，在1 min内将近端平均动脉压降至45 mmHg，记录血压及放血量。10 min后，松开球囊，立即匀速回输放血装置内的血液，回输时间控制在1 min左右。

术后监测血压l0 min后取出动脉插管，结扎动脉，皮下注射硫酸鱼精蛋白4 mg。动物置25～30℃保温箱内，等待动物苏醒后放回饲养笼中。

药物组大鼠于脊髓缺血前30 min腹腔注射相应剂量人参皂甙Rb1，术后每天腹腔注射相同剂量人参皂甙Rb1。

实验中意外死亡大鼠，随机另取大鼠补充。

1.4 BBB评分

造模后48 h，各组大鼠行BBB评分。评分人员为未参加本组实验而熟悉评分标准的人员。

1.5 标本采集

BBB评分后，心脏采血3 ml，室温放置2 h后，1000 r/min离心10 min，取血清，置于-20℃冰箱保存。心脏采血后，予3%苯巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，升主动脉插管，剪开右心房，快速灌注生理盐水250 ml后，继续灌注4%多聚甲醛至右心房流出清亮多聚甲醛、尸体僵硬。立即取出腰段脊髓1 cm，4℃ 4%多聚甲醛后固定24 h，自来水浸洗24 h，石蜡包埋，于L3节段2 mm范围内连续切片，厚10 μm。

1.6 HE染色

取各组脊髓组织石蜡切片行HE染色。

1.7 免疫组织化学染色

各组脊髓组织石蜡切片脱蜡，梯度乙醇和蒸馏水复水，3%H2O2孵育30 min，滴加5%BSA封闭液，室温20 min，滴加survivin一抗(1∶100)，湿盒内4℃过夜。滴加生物素化二抗工作液，室温20 min；滴加SABC，室温15 min。DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化。采用高清晰彩色医学图文分析系统，每张切片取5个不同视野拍片，进行图像分析，计数脊髓前角survivin阳性神经元。

1.8 TUNEL检测

石蜡切片脱蜡及复水同前，使用PBS液处理。采用高清晰彩色医学图文分析系统，每张切片随机取5个不同视野拍片，进行图像分析，计数脊髓前角TUNEL阳性神经元。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 BBB评分

模型组BBB评分较假手术组下降(P＜0.05)。各药物组BBB评分虽较假手术组降低(P＜0.05)，但比模型组高(P＜0.05)。随着药物剂量的增大，评分也相应增高，但D40组与D80组相差不大。见表1。

2.2 HE染色

假手术组脊髓神经元胞浆内尼氏体清晰可见；模型组神经元皱缩，尼氏体模糊且数量减少，脊髓组织出现大小不一的空泡变性；各药物组均可见损伤性改变，但损伤程度较模型组轻。见图1。

2.3 免疫组化及TUNEL染色

模型组脊髓前角survivin蛋白阳性细胞较假手术组增多(P＜0.05)，TUNEL阳性细胞增多(P＜0.05)。各药物组survivin蛋白阳性细胞较模型组增多(P＜0.05)，TUNEL阳性细胞数减少(P＜0.05)。随着药物干预剂量增大，survivin蛋白阳性细胞数增多，TUNEL阳性细胞数减少，但D40组与D80组相差不大。见表1、图2、图3。

survivin蛋白阳性细胞数与TUNEL阳性细胞数呈负相关性(r=-0.601,P＜0.05)。

图1 各组脊髓HE染色(400×)

图2 各组脊髓survivin免疫组化染色(400×)

表1 各组BBB评分、脊髓survivin阳性细胞计数、脊髓TUNEL阳性细胞数比较

3 讨论

本研究显示，大鼠脊髓缺血再灌注损伤可使脊髓前角survivin阳性细胞数增多；予人参皂甙Rb1干预后，survivin阳性细胞数继续增多，并随药物剂量增大而增加，但大于40 mg/kg后，这种趋势不再明显。这种变化与大鼠脊髓前角神经细胞凋亡数呈负相关。

survivin由142个氨基酸构成，其N-端杆状病毒IAP重复结构(baculorius-IAP repeat,BIR)域可抑制procaspase-3/procaspase-7或caspase-3/caspase-7的活性，抑制凋亡；C-端没有其他IAP家族成员所具有的环指状结构。survivin单体通过BIR域相互聚集，结合成对称二聚体，这种结构为survivin抗凋亡所必需。survivin的分布具有细胞选择性，在胚胎及胎儿组织器官中高度表达。但成人除了胸腺、肾脏、胎盘、睾丸等终末分化组织外，并无表达。目前多数研究着眼于肝癌、肺癌及淋巴瘤等肿瘤方面的研究[4]，仅有少量研究提示，survivin可在脑细胞缺血再灌注损伤后表达升高[6]。survivin可以与X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)结合，形成survivin-XIAP复合物，促进XIAP稳定性并协同抑制caspase-9，发挥细胞保护作用。也有文献指出[7]，survivin不能通过与XIAP结合抑制凋亡。survivin可以在凋亡过程中，特异性调节线粒体内膜蛋白Smac/Diablo的释放，还通过与Smac/Diablo结合，延迟其释放[8]。现有研究发现，脊髓缺血再灌注损伤后，细胞凋亡主要发生在前角，但具体机制尚不清楚[9]。

人参皂甙是人参的主要活性成分。人参的根茎中含有2%～3%人参皂甙，主要是Rg1、Rc、Rd、Re、Rb1、Rb2及Rb0。西洋参人参皂甙含量最高。人参皂甙有与糖基链接4环甾类结构，迄今已从西洋参根茎种发现并分离出超过40种人参皂甙。每种人参皂甙至少含有2个(C-3及C-20)或3个(C-3、C-6及C-20)羟基基团，羟基集团可以不与糖基相连，也可以单体、二聚体或三聚体形式与糖基相连。由于C-20位羟基基团的位置存在变化，所以人参皂甙同样具有立体异构体。根据人参皂甙的分子结构，可以将其分为人参二醇(protopanaxadiol,PD)及人参三醇(protopanaxatriol,PT)两类。PD包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2及Rh3，其糖基与3-位达玛烷型三萜相连。PT包括Re、Rf、Rg1、Rg2及Rh1，其糖基与6-位达玛烷型三萜相连[10]。伪人参皂甙F11属于PT，其碳链20位C被四氢呋喃环所取代。25-OH-PPD及25-OH-PPT等新发现的人参皂甙从人参的果实中分离出来，具有明显抗癌作用[11]。人参皂甙Rb1、Rb2、Rc及Rd的4种丙二酰基衍生物也被发现。Ro及这些丙二酰基衍生物也被称为酸性人参皂甙，而其他人参皂甙被称为中性人参皂甙。

人参皂甙Rb1属PD，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老作用，可以有效阻断超氧阴离子生成，并下调内皮型一氧化氮合酶。人参皂甙Rb1对缺血性脑损伤有保护作用，在脑缺血后自由基大量生成时，可作为自由基清除剂发挥作用[12]。人参皂甙Rb1可通过蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信号传递途径使突触磷酸化，从而促进神经递质的释放[13]。人参皂甙Rb1是糖皮质激素受体及雄激素受体的配体，作为激动剂可以促进离子快速内流及一氧化氮生成[14]。人参皂苷还能通过影响身体内某些微生物间相互转化，达到抗炎、抗菌作用[12,15]。

在动物实验中，人参皂甙可以抑制血小板聚集。人参皂甙可以促进血小板cAMP水平升高，降低血栓素A2的生成及释放，抑制前列环素生成。人参皂甙干预8周，可以延迟主动脉粥样硬化斑块的形成。人参皂甙Rb1以剂量依赖方式，促进绵阳红细胞葡萄糖摄取；人参皂甙Rb2可以通过促进糖酵解酶的活性，调节胰岛素的分泌及糖代谢。人参皂甙Rg1及Rb1可促进大鼠大脑皮层神经末梢谷氨酸释放，对学习、记忆等认知功能有促进作用。在动物实验中，人参皂甙对某些疾病及反应具有保护或抑制作用[16-17]。人参皂甙Rb1对缺血性脑损伤及螺旋神经节细胞损伤具有保护作用，其作用类似于亲神经因子[18]，提示人参皂甙可能对帕金森病及阿尔茨海默病等神经变性疾病有治疗作用[19]。人参皂甙Rd具有免疫佐剂作用，可以通过调节Th1及Th2细胞因子的基因表达等作用，诱导Th1及Th2细胞免疫反应。在大鼠血管性痴呆模型中，人参皂甙Rg2可通过抗凋亡，保护记忆功能；可能对血管性痴呆及其他缺血性损伤有治疗意义[20]。人参皂甙Rg2还对病毒感染造成的细胞坏死有保护作用[21]，通过自噬纠正由于细胞能量代谢异常导致的脂肪堆积[22]。

本研究显示，在大鼠脊髓缺血再灌注损伤过程中，人参皂甙Rb1可通过促进survivin表达，抑制凋亡等途径发挥保护作用。在10～40 mg/kg剂量范围内，其保护作用随剂量增大而增强。这为人参皂甙Rb1在临床上的应用提供了动物实验基础。

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