HBVpreC/C区基因突变与原发性肝癌预后的关系

吴忱思 吴建华 赵乐 王英南 张风宾 张卫国 张瑞星

050011石家庄,河北医科大学第四医院消化内科(吴忱思、赵乐、王英南、张风宾、张瑞星),实验动物中心(吴建华)；050011石家庄,河北医科大学《临床荟萃》编辑部(张卫国)

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全球范围内发病率第5位的常见恶性肿瘤,每年约有70万人死于肝癌,该病易复发、预后差,其死亡率位居恶性肿瘤第2位[1]。目前,HCC的发病机制尚未完全明确,有研究表明,肝脏炎症程度、肿瘤病理类型、肿瘤数量、肿瘤大小和脉管瘤栓,是评价肝癌患者预后的独立预测因子[2-3]。在亚洲和非洲,肝细胞肝癌患病率呈逐年上升趋势,其主要和这些区域乙型肝炎病毒感染流行有关,在亚洲,肝癌约80%以上是由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染所致。因此,HBV与HCC之间的关系已成为原发性肝癌研究领域的热点。

HBV是一种嗜肝病毒,据世界卫生组织报道,全球每年大约有100万人死于其感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。根据乙型肝炎病毒的全基因序列差异(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536),已经鉴定出了A～J 10个基因型,其中,在东亚,HBV主要为B和C基因型[4]。在我国,HBV感染率高,大约9 300万人是HBV携带者,3 000万人患有慢性乙型病毒性肝炎[5]。HBV基因组包含四个重叠的开放读码框(open reading frame,ORF),即P、X、pre S/S、pre C/C 基因区,分别编码聚合酶蛋白、X蛋白、外膜蛋白和核壳蛋白。由于缺少HBV聚合酶的校正,HBV DNA非常容易发生基因突变[6-7]。HBV基因突变与肝癌发病风险的关系已经被广泛研究[8-11],但是HBV基因突变与HBV-HCC预后关系的研究则相对较少。Kim等[12]研究发现基本核心启动子(the basal core promoter,BCP)区域的A1762T/G1 764 A突变与乙肝相关性肝细胞肝癌的预后相关,本研究扩展到HBV preC/C区基因,探讨其突变位点与HCC预后的关系。

1 材料与方法

1.1 收集肝癌组织标本和提取HBV DNA81例癌组织标本均来自于2007—2009年在河北医科大学第四医院行手术治疗的HBV-HCC患者。标本采集经患者或家属知情同意。患者年龄30～86岁,其中女性患者10例,男性患者71例,中位年龄54岁,患者均排除其他肝脏疾病(如自身免疫性肝炎、HCV感染等)并被证实感染HBV。实验过程经过河北医科大学第四医院伦理委员会批准。用Promega公司DNA试剂盒提取基因组DNA,并置于-20℃冰箱备用。

1.2 PCR扩增及基因测序应用Life Technologies公司的ABI 7300 TaqMan平台,通过多重PCR法测出HBV-HCC患者癌组织的HBV基因型。并通过NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/5536)查找引物(见表1),对 HBV preC/C区的DNA序列进行扩增,将其产物纯化处理后进行测序分析。采用双向重复测序方法对同一标本进行测序分析。

1.3 统计学方法应用χ2检验、Kaplan-Meier、Logrank test、和Cox回归分析对统计数据进行处理分析。所有的统计处理操作均应用IBM公司的SPSS 18.0软件,Ρ＜0.05被认为差异有统计学意义。

表1 HBV preC/C区基因PCR扩增和测序引物Tab.1 Primers used in PCR amplification and sequencing in the preC/C region gene

2 结果

2.1 HBV-HCC患者的临床特征对接受手术治疗的81例HBV-HCC患者术后进行随访,时间为3年,每3个月随访1次,将其进行基因分型如下：46例为B型,35例为C型。分析其临床特征与术后生存期之间的关系,结果显示门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小与HBV-HCC患者的生存相关(见表2)。并将以上3个因素引入Cox比例风险模型,进行多因素方差分析,结果显示门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小被确定为与HBV-HCC患者术后生存相关的独立危险因素。

表2 HBV-HCC患者的临床因素Tab.2 The analysis of clinical factors in HBV-HCC patients

2.2 HBV preC/C区基因突变与生存的相关性本研究对HBV preC/C区的DNA序列进行基因测序。使用Log-rank test和Cox比例风险模型分析HBV突变与HBV-HCC生存之间的关系,发现18个位点的突变频率大于5%(见表3),应用Log-rank test和Kaplan-Meier进行分析,在这18个位点中,7个位点(1915、2134、2176、2221、2260、1979、2245)与HBV-HCC患者术后生存相关。如表3所示,以下5个突变位点具有显著的统计学差异,被确定为预测HBV-HCC患者生存相关的独立危险因子：1915位点(P=0.024),2134位点(P=0.006),2176位点(P=0.002),2221位点(P=0.001)和2260位点(P=0.016)。另外,1979和2245突变位点与HCC患者的生存具有临界统计学差异：1979位点(P=0.098),2245 位点(P=0.052)。 将 1915、2134、2176、2221、2260和2245位点与临床因素相关联进行多因素方差分析,由于1979位点P值较大故未引入进行多因素方差分析,结果显示 1915位点(RR：0.195,95%CI：0.044～0.855,P=0.030)存在明显统计学差异,而2 221 位点(RR：2.815,95%CI：0.918 ～8.632,P=0.070)存在临界统计学差异(表4)。

表3 与HBV-HCC术后患者生存相关的HBV preC/C区基因突变位点Tab.3 HBV preC/Cregion mutations associated with postoperative survival in HBV-HCCpatients

表4 与HBV-HCC术后患者生存相关的临床特征与HBV preC/C区基因突变位点Tab.4 Multivariate analysis of clinical characteristics with postoperative survival in HBV-HCCpatients and the HBV preC/Cregion mutations

3 讨论

HBV属嗜肝DNA病毒科,HBV非常容易发生基因突变。既往研究发现HBV突变主要集中在HBV基因组的特定区域,例如基本核心启动子BCP区、pre S/S区和pre C/C区[13]。本研究重点观察HBV DNA序列中HBV preC/C区,研究该区域基因突变位点与HBV-HCC预后的关系,并通过统计分析鉴定出与HBV-HCC生存相关的7个突变位点。结果表明,HBV preC/C区基因突变不仅与HCC发生有关,也与HCC患者术后生存相关。

目前,HBV感染在东南亚地区非常普遍,已经成为威胁人群健康的主要问题[14]。HBV preC/C区基因是HBV四个ORF之一,其主要编码乙型肝炎e抗原(hepatitis B virus e antigen,HBeAg)和核心蛋白。BCP区中的突变G1 896 A和A17 62T/G1 764 A双突变,可使HBeAg表达下降[15]。在过去的几年中,有研究明确了导致HCC的两个HBV突变位点[16-17]。其中,G1 896 A和C2 288 A可以引起氨基酸残基的突变。然而,只有G1 896 A已经被深入地研究,G1 896 A突变导致preC/C区基因第28位密码子由TGG变为终止密码子TAG,通过该突变可以将终止密码子引入preC/C区基因的开放阅读框,从而阻止HBeAg的产生,并且研究显示该突变与肝癌发生相关[17]。HBV preC/C区基因共同编码HBeAg,HBeAg可以刺激机体产生抗体,其抗体在细胞免疫和体液免疫中发挥着清除HBV的作用,Gl896 A突变使得preC基因不能与C基因共同编码转译出完整的HBeAg,从而导致病毒逃逸机体对病毒的免疫清除作用[18-19]。Kim等[12]证实可以引起密码子突变的HBV preC/C区基因突变位点与HCC相关,该研究结果还表明,在HBV preC/C基因区,除了G1 896 A导致密码子突变与HCC相关之外,仍然存在与HCC相关的突变位点。因此,为了深入研究HCC相关的突变位点及其作用机制,需要从人体试验和实验室水平进一步验证并阐明。

本研究中,在HBV preC/C区基因中鉴定出了与HBV-HCC生存相关的7个突变位点：1915,2134,2176,2221,2260,1979和2245。这些突变位点在肝癌的发病机制中发挥着重要作用。Rajesh等人在对印度北部HBV感染者基因型研究中也发现了A19 15G突变。Akuta等[21]研究发现C基因区2134位点突变可作为判断HBV抗病毒药物治疗是否有效的独立预测因子。荆永正等人[22]研究发现乙型病毒性肝炎患者C222 1T突变出现在C基因区,未导致氨基酸突变,为同义突变。C基因编码HBc Ag(hepatitis B virus c antigen,HBcAg),它可以刺激机体产生相应的抗体,HBcAg表达于肝细胞膜表面,C基因的突变可导致HBcAg抗原位点改变,从而形成细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)对HBcAg的识别逃逸,这是HBV感染肝细胞后清除病毒及造成肝损伤的重要机制之一[23]。近年来,多项研究表明程序性死亡因子l(programmed death 1,PD-1)和程序性死亡因子配体1(programmed death ligand 1,PD-L1)是参与肿瘤免疫逃逸的重要环节,且与T淋巴细胞免疫功能缺陷相关,HBcAg可以通过JNK、ERK和P13 K/AKT信号通路促进PD-1的高表达,而高表达的PD-l促进HBV特异性CD8+T淋巴细胞凋亡和抑制其抗病毒功能[24]。并且大量研究表明HCC肿瘤组织中PDL1表达水平显著升高[25-26]。PD-1与PD-L1结合后可导致T细胞凋亡,从而引起免疫逃逸状态,促进HCC的形成[27]。本研究对于HBV DNA突变位点的研究分析,鉴定出与HCC预后关联的HBV preC/C区基因突变位点,为肝癌的预防和治疗提供了新的靶点,有利于鉴别预后不良的肝癌患者,及早进行治疗及干预,对于提高肝癌患者的生存期、改善其预后具有重要的意义。

利益冲突无