汉麻籽多肽粉经口急性毒性试验研究

宋淑敏，刘宇峰，魏连会，董 艳，潘 静

（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319）

0 引言

汉麻（Cannbis sativa L.Hemp）也称为工业大麻、火麻，是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻类型，是大麻科大麻属一年生草本植物[1]。汉麻的根、茎、叶和籽都可以开发利用，产业涉及纺织、食品、医药、建材等领域[2]。

汉麻籽具有很高的营养价值，汉麻籽中蛋白质含量较高，含量为20%～25%，经脱脂的汉麻籽粕蛋白质含量达50%以上。汉麻蛋白质中含有21种氨基酸，其中包括人体所需的8种氨基酸。汉麻蛋白的65%为麻仁球蛋白，麻仁球蛋白对促进消化有很好的作用，另外35%为白蛋白，也是一种优质蛋白[3]。2002年，卫生部将火麻仁（汉麻籽仁）列为“既是食品又是药品”的目录，为汉麻籽的食品级应用敞开了大门。多肽是蛋白质酶解过程的中间产物。研究表明，多肽无论从理化特性、营养特性都显著优于蛋白，多肽具有良好的溶解性、耐酸、热稳定性、黏度低等理化性质；比蛋白质更易吸收，同时具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、提高免疫力等多种功效[4]。目前，采用酶法制备汉麻籽多肽技术已经成熟[5]，但关于汉麻籽多肽急性毒性方面的研究还未见报道，为确保其食用的安全性，对汉麻籽多肽粉的急性毒性进行了研究，以期为汉麻籽多肽在食品、药品等领域开发应用提供科学依据。

1 材料和仪器

1.1 仪器

MOL-300型全自动生化分析仪，上海力申科学仪器有限公司产品；FA1104N型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司产品；DHG-9070A型鼓风干燥箱，上海飞跃实验仪器有限公司产品；BIOQ-MU1000型切向超滤系统，汇和堂生物工程设备公司产品；VFD-6000型真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品；Master-DUF型超纯水机，上海和泰仪器有限公司产品；GL10M大型离心机，湖南湘立科学仪器有限公司产品。

1.2 汉麻籽多肽粉

汉麻籽多肽粉由黑龙江省科学院大庆分院研制。汉麻籽多肽粉样品为乳白色粉末状，无特殊气味。放置-20℃冰箱中保存，试验时以蒸馏水制成所需浓度的混悬液。

1.3 试验动物

SPF级KM小白鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，动物合格证号为SCXK（黑） 2013-001。

1.4 试验条件

实验室温度24±2℃，湿度50%±5%。每只塑料小鼠笼放养5只小鼠，提供符合要求的基础饲料和清洁水供动物自由摄食、饮用。

2 试验方法

2.1 汉麻籽多肽制备

以脱脂的汉麻籽粕为原料，采用木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复配水解的方法，通过正交试验优化双酶水解的酶解条件，提高蛋白的水解度。

2.2 汉麻籽蛋白酶解液的分离纯化及冷冻干燥

制备汉麻籽蛋白酶解液经灭酶，再以转速6 000 r/min离心15 min，收集上清液。采用离心及超滤系统，利用5 000 Da的超滤膜包，截留分子量为5 000 Da以下的多肽液，进一步纯化汉麻籽多肽。将5 000 Da以下多肽液放入真空冷冻干燥机中，进行冷冻干燥制备汉麻籽冻干粉，将汉麻籽多肽粉放置于-20℃冰箱中保存备用。

2.3 汉麻籽多肽粉急性毒性试验

依据中华人民共和国国家标准《食品安全国家标准经口急性毒性试验》 （GB 15193.3—2014）。根据预试验结果，正式试验采用限量法进行试验。健康昆明种小鼠雄、雌各10只，试验前禁食4～6 h，自由饮用清洁水。精确称取受试样品20 000 mg加蒸馏水定容至40 mL成均匀悬液，每只小鼠按20 mL/kg·bw体积于12 h内经口灌胃2次上述样品的混悬液（此为最大使用浓度和最大灌胃体积，2次灌胃间隔时间为6 h），2次总剂量达20 000 mg/kg·bw，末次灌胃1～2 h后喂饲饲料和水。对给予受试物的小鼠进行连续观察14 d。记录小鼠试验时的初始体重、7 d时体重及14 d时体重；观察并记录小鼠的中毒症状和死亡结果，对濒死的小鼠和试验结束时存活小鼠进行主要器官大体病理学检查，如发现有可疑病变时进一步做病理组织学检查。疑病变时进一步做病理组织学检查。

3 结果分析

3.1 木瓜蛋白酶与中性蛋白酶复配酶解条件的优化

在木瓜蛋白酶、中性蛋白酶酶解条件单因素试验的基础上，采用2种酶复配酶解汉麻籽蛋白的方法，以水解度为指标，采用L9（34）正交试验对pH值、酶解温度、酶添加量进行优化，料液比1∶5，酶解时间3 h，筛选中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复配的最佳酶解条件。

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶复配酶解正交试验结果见表1，9个处理对多肽得率的影响见图1。

表1 木瓜蛋白酶、中性蛋白酶复配酶解正交试验结果

图1 9个处理对多肽得率的影响

由表1和图1可知，以处理3的水解度、多肽得率较高，分别为22.63%，82.64%。从极差的分析结果可以看出，影响汉麻蛋白水解度的因素主次关系为B＞A＞C＞D，温度对水解度的影响最大，其次是pH值。双酶复配酶解的最佳条件组合为A1B3C2D3，即酶解温度70℃，pH值5.0，木瓜蛋白酶添加量0.4%，中性蛋白酶添加量3.0%。经试验验证，该工艺条件下的DH为27.23%，多肽得率85.64%。

3.2 多肽的分离纯化及冷冻干燥

将汉麻籽蛋白酶解液经转速6 000 r/min离心15 min，收集上清液。通过切向流超滤系统，截留分子量5000Da以下的小分子肽。超滤系统的压力在0.8～1.0 Bar，流速0.93 r/min。将分子量5 000 Da以下和5 000 Da以上的多肽液放入真空冷冻干燥机中分别进行低温冷冻干燥，制备汉麻籽多肽冻干粉。结果表明，分子量5 000 Da以下小分子肽占多肽总量的90%以上。

3.3 汉麻籽多肽粉急性毒性试验

试验依据中华人民共和国国家标准《食品安全国家标准经口急性毒性试验》 （GB 15193.3—2014），采用限量法对每只小鼠按20 mL/kg·bw体积于12 h内经口灌胃2次上述汉麻籽多肽粉的混悬液，2次总剂量达20 000 mg/kg·bw，末次灌胃1～2 h后喂饲饲料和水。对受试小鼠行为、体重、死亡情况进行连续14 d观察，14 d后对受试小鼠进行大体病理学观察。

3.3.1 小鼠的行为

在14 d的观察期内，小鼠活动、反应正常，进食、大小便正常，未见腹泻、呼吸困难、流血、流鼻涕等异常现象。

3.3.2 小鼠体重变化

汉麻籽多肽粉小鼠经口急性毒性试验体重变化结果见表2。

表2 汉麻籽多肽粉小鼠经口急性毒性试验体重变化结果

由表2的试验结果可以看出，在灌胃剂量为20 000 mg/kg·bw，通过对小鼠的初始体重、7 d时体重、14 d时体重的记录。结果表明，灌胃雌、雄小鼠均未出现拒食现象，体重均正常增长。

3.3.3 小鼠死亡情况

对给予灌胃剂量20 000 mg/kg·bw的雌、雄各10只小鼠，进行14 d的观察，20只小鼠全部存活，未发现死亡小鼠。

汉麻籽多肽粉小鼠经口急性毒性试验结果见表3。

3.3.4 病理学检查

表3 汉麻籽多肽粉小鼠经口急性毒性试验结果

试验结束后，对受试小鼠的主要器官进行大体病理学检查，主要对小鼠的心脏、肝脏、脾、肾、胃等器官进行病理学检查，未见脏器异常改变。解剖小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾、胃等器官的形状、大小、表面黏膜附着情况均正常，无病理病变。

综上，小鼠经口灌胃受试物后，连续观察14 d未见任何中毒症状和表现，亦无死亡发生；对所有存活动物进行大体病理学观察，未见脏器异常改变。

4 结论

结果表明，对受试小鼠进行连续14d的观察，未见任何中毒症状和表现，亦无死亡发生；对小鼠进行大体病理学观察，未见脏器异常改变。根据中华人民共和国国家标准《食品安全国家标准经口急性毒性试验》 （GB 15193.3—2014） 附录G急性毒性（LD50）剂量分级表及试验结果，受试样品汉麻籽多肽粉对雌、雄小鼠经口LD50均大于20 000 mg/kg·bw，属实际无毒物质，证明酶法制备的汉麻籽多肽具有良好的食用安全性。研究为汉麻籽多肽在食品、医药等领域的开发应用提供了依据。

参考文献：

[1]关凤芝.大麻遗传育种与栽培技术 [M].哈尔滨：黑龙江人民出版社，2010：153-160.

[2]许树文，刘华．工业大麻的开发利用及其市场前景 [J].纺织导报，2005，27（7）：62-64．

[3]何锦凤，张琨，陈天鹏.汉麻籽的营养成分和功能 [J].食品科技，2007（6）：258-259.

[4]孔令明，李芳，陶永霞，等.多肽的功能活性与研究进展 [J].中国食品添加剂，2009（3）：71-72.

[5]宋淑敏，魏连会，董艳，等.复合酶法制备汉麻籽多肽的工艺研究 [J].农产品加工，2016（10）：22-24.◇