苦豆子生物碱浸提物的抑菌性研究

余永婷，冯作山

（1.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐 830021；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

0 引言

苦豆子（Sophora alopecuraides L.）属于豆科槐属，又称苦豆根、欧苦参、苦豆草、西豆根、苦甘草等[1]，西北区域为苦豆子主产区。其所含有效成分中包含较多生物碱，生物碱总量在全草、种子中的占比分别达6.11%～8.03%，8.11%，所含生物碱20多种，包括氧化槐碱、金雀花碱、氯化苦参碱、苦豆碱、槐定碱、苦参碱与槐果碱等[2]。基于我国传统医学观点，苦豆子味苦性寒，具备解毒、利尿退黄、祛湿清热等功效。通过对苦豆子进行现代药理学研究，发现其所含药物活性物质是苦参碱类，此生物碱具备诸多功效，如清热燥湿、降血脂降压、杀虫、降温镇痛、抗病毒、抗溃疡、抗炎、抗腹泻与利尿等[3]。现今，在研究与应用苦豆子方面，全球都将生物碱作为重点。试验对苦豆子生物碱抑菌性展开测定，对其抑菌效应进行观察，研究此药物生物碱的抑菌功能，可将研究结果作为理论依据供苦豆子在防腐、食品保鲜和医药价值研发所需。

1 材料与设备

1.1 材料

苦豆子来源于新疆，所用菌株由微生物实验室提供。

细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcu saurers）、枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、痢疾志贺氏菌（Shigelladysenteriae）、四联球菌（Micrococcus tetragenus）；酵母菌：酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）；霉菌：根霉（Rhizopus sp.）、毛霉（Mucor）/黑曲霉（Aspergillus sp.）。

培养基：察氏琼脂/牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。

1.2 仪器设备

电子天平、722型可见光分光光度仪、电热恒温水浴锅、N-1001型系列EYELA旋转蒸发仪、DZF-6090型真空干燥箱、DELTA320型pH计、恒温培养箱、YXQ-SG-280型医用杀菌锅等。

2 试验方法

2.1 提取苦豆子生物碱的浸提物和制剂的制备[4-5]

精准称量0.1 kg苦豆子粉，在室温下，由酸性乙醇溶剂对其浸泡4次，4 d/次。回收溶剂，接着进行真空干燥，获得总浸提物，然后依次通过脱脂处理、酸化处理、碱化处理、氯仿萃取处理环节，获得苦豆子生物碱提取物。精准称量10 g苦豆子生物碱，放在烧杯内，滴加2 mL盐酸溶液（10 mL/L）使其溶解，加蒸馏水至80 mL，加4 g活性炭，煮沸15 min，过滤澄清后滤液加蒸馏水至100 mL，调节pH值5～6，于100℃条件下灭菌30 min后备用。

2.2 苦豆子生物碱浸提物的抑菌试验[6-7]

常用的滤纸片法测定苦豆子生物总碱的抑菌作用：借助打孔器，把定性滤纸制作为小圆片（φ9 mm），然后置于培养皿内，于高压条件下实施灭菌处理。分别把经过灭菌的滤纸片置于下述3类溶液内进行浸泡：①0.1 mg/mL的苦豆子生物碱液；②无菌水；③0.1%的苯甲酸钠溶液。均进行12 h充分浸泡。分别吸取各菌悬液100μL，于无菌环境中，放置在已预先制备的培养基平板内，在三角刮铲协助下，做到均匀涂布。然后，借助经过灭菌处理的镊子夹取已浸透的滤纸片贴于已接种的平板上，将培养皿背侧划分出3个部分（面积相等），将含苦豆子生物碱提取物滤纸片贴在其中一部分上，一部分则贴无菌水浸过的滤纸片作对照试验，剩余部分贴含0.1%无菌苯甲酸钠的滤纸片，2片滤纸需保持一定间距。然后，把此平板置于恒温培养箱内进行培养，将酵母菌置于30±1℃培养箱内培养24 h；细菌培养时间18～24 h，温度36±1℃；霉菌培养时间48 h，温度28±1℃。对各抑菌圈直径进行测量，为了获得准确的检测数据，各菌需安排3个重复。

2.3 苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响[8]

2.3.1 pH值对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响

在无菌操作条件下，分别移取10 mL稀释过的苦豆子生物碱液于7个无菌小烧杯中，在这些小烧杯内分别加入一定浓度的氢氧化钠或盐酸溶液，以此调节苦豆子生物碱提取液酸碱度，其中pH值最低为4.0，最高为10.0，二者之间的pH值还有5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，借助采取同以上滤纸片法一致操作，平行操作2次，求其平均值，比较不同的pH值对苦豆子生物碱提取液抑菌活性的影响。

2.3.2 温度对苦豆子生物碱浸提物抑菌的影响

在无菌操作条件下，分别移取5 mL苦豆子生物碱提取液于5个无菌小烧杯中，把滤纸片分别放入25，76，100，121℃的水浴中加热的烧杯中加热2 h；接着采用以上滤纸片法一致操作，进行2次平行操作，以均值为准，针对温度影响此提取液抑菌活性程度展开对比分析。

2.4 苦豆子生物碱浸提物对致病菌作用时间与抑菌率的关系[9]

分别测定不同浓度的苦豆子生物碱提取液对革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌的大肠杆菌作用时间与抑菌率之间的关系。在无菌操作条件下，分别用0.1 mL枯草芽孢杆菌和0.1 mL大肠杆菌悬液与2倍稀释法稀释好的苦豆子生物碱提取液1 mL充分混合，设定作用时间为1，3，6，9，12 h；吸取0.2 mL混合菌悬液移至无菌平皿内，再将固体培养基（温度为60℃上下）倒入，彻底混匀，静置凝固，然后倒置在培养箱内进行1 d培养，温度为37℃。另外，在0.1 mL大肠杆菌悬液与0.1 mL枯草芽孢杆菌悬液内分别滴加0.2 mL无菌水，且分别混匀，将固体培养基倒入，将所制平板当做对照，置于培养箱中进行1 d培养，温度37℃；对菌落数进行准确统计，采取以上滤纸片法，进行2次平行重复操作，同时通过公式（1），对抑菌率进行求解。

3 结果与分析

3.1 苦豆子生物碱浸提物的抑菌作用

苦豆子生物碱浸提物对试验菌的抑制效果见表1。

表1 苦豆子生物碱浸提物对试验菌的抑制效果（抑菌圈大小）/mm

由表1可知，苯甲酸钠与苦豆子生物碱浸提物抑菌作用之相比，抑菌效果较差。苦豆子生物碱浸提物具备一定抑菌功能，包括细菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌与产气肠杆菌。其中，后2种抑制作用更为突出。此次试验所涉及菌种有3类，此浸提物可明显抑制的为黑曲霉，抑制根霉与毛霉效果不明显。

3.2 苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响

3.2.1 不同温度对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响

不同温度对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响见表2。

由表2可知，在较高温度下，苦豆子生物碱浸提物呈现出一定稳定性。在温度提高后，抑菌能力随之增强。导致此结果的原因可能为此浸提物在温度提升下浓度变大，从而抑菌能力提升。

表2 不同温度对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响

3.2.2 不同pH值对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响

不同pH值对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响见表3。

表3 不同pH值对苦豆子生物碱浸提物抑菌活性的影响

由表3可看出，当苦豆子生物碱所处环境pH值为8时，抑菌作用最突出。

3.3 苦豆子生物碱浸提物对致病菌作用时间与抑菌率的关系

不同质量浓度的苦豆子生物碱浸提物对大肠杆菌作用时间与抑菌率的关系见图1，不同质量浓度的苦豆子生物碱浸提物对枯草芽孢杆菌作用时间与抑菌率的关系见图2。

图1 不同质量浓度的苦豆子生物碱浸提物对大肠杆菌作用时间与抑菌率的关系

由图1和图2可知，在同一质量浓度的苦豆子生物碱浸提物作用时间越长，其抑菌率也越高；而且相同时间内，苦豆子生物碱浸提物的质量浓度越高，抑菌率越高。就大肠杆菌与枯草芽孢杆菌而言，相比革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌的抑制性更强。

4 结论

图2 不同质量浓度的苦豆子生物碱浸提物对枯草芽孢杆菌作用时间与抑菌率的关系

通过此次抑菌试验可知，苦豆子生物碱浸提物对细菌表现出一定的抑制效应，针对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌，所对应的MIC值依次是12.50，5.25，5.25，25.00μg/mL。在此浸提物抑菌效果上，相比细菌，对酵母菌未表现出显著抑制性，对应酵母菌的MIC值是25μg/mL，就试验所涉及的3类菌种而言，可有效抑制黑曲霉，未见明显抑制根霉与毛霉。

对于苦豆子生物碱浸提物抑菌效果而言，温度越高，苦参碱的抑菌效果越显著；在不同的pH值范围内均较稳定，在弱碱性条件下（pH值8左右） 其抑菌作用较好；当作用时间既定时，抑菌效果随着质量浓度的提升而愈加明显；当质量浓度一定时，作用时间愈长，抑菌效果越明显。通过对比此浸提物分别抑制枯草芽孢杆菌与大肠杆菌的表现可知，相比革兰氏阴性菌，其抑制革兰氏阳性菌的作用较强。

参考文献：

[1]江苏新医学院.中药大辞典 [M].上海：上海科技出版社，1997：1 293-1 294.

[2]张兰珍，李家实.苦豆子种子生物碱成分研究 [J].中国中药杂志，1997，22（12）：740-743.

[3]熊鑫，郭树奇，李琳.苦豆子生物碱对番茄生长及果实品质的影响 [J].中国农业科学，2015，48（9）：1 737-1 746.

[4]秦学功，元英进.苦豆子种子中生物碱的冷浸提取试验研究 [J].中草药，2001，32（7）：604-606.

[5]赵辉，赵志刚.苦豆籽中总生物碱的含量测定 [J].化学研究与应用，2001，13（2）：211-212.

[6]魏玉西，帅莉，郭道森，等.辣椒碱的抑菌活性研究 [J].食品科学，2006，27（8）：76-78.

[7]浓萍，范秀容，李广武.微生物学实验 [M].北京：高等教育出版社，2015：75-80.

[8]邸大琳，李法庆，陈蕾，等.苦参体外抑菌作用的研究 [J].时珍国医国药，2006，10（17）：1 974-1 975.

[9]张义英，王俊儒，龚月桦，等.骆驼蓬醇提物抑菌活性的初步研究 [J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2006，11（34）：122-125.◇