红叶石楠叶绿素的提取与纯化及抗氧化活性研究

霍湘芸，蒋耀瑛，王岁楼

（中国药科大学工学院，江苏南京 211198）

0 引言

叶绿素在自然界中普遍存在，有许多生物活性和生物功能，能降低胆固醇、抗衰老、排毒消炎，具有抗癌抗突变、抗贫血、保肝等功能[1]。红叶石楠作为一种观赏植物，常用于园林绿化，目前尚无其他用途。据介绍，石楠叶中含有多种活性物质，目前已从中提取出了熊果酸、齐墩果酸[2-3]、黄酮类化合物、绿色素类，但对于其品种之一的红叶石楠，还没有提取叶绿素等功能性色素的报道。对红叶石楠叶绿素的提取工艺进行优化，并对其体外抗氧化活性进行了初步研究，旨在为其开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石楠叶：新鲜红叶石楠叶片，2017年5月采摘于中国药科大学江宁校区食堂门口。选择颜色鲜亮、形状完整的叶片，洗净、沥干水分，于40℃烘箱中烘干，恒质量后真空干燥1 h，取出粉碎后过100目筛，避光保存。

主要试剂：丙酮、石油醚、无水乙醇、氧化铝、焦性没食子酸、七水合硫酸亚铁、水杨酸、30%过氧化氢、硅藻土等，均为分析纯试剂；柱层析硅胶，100～200目。

主要仪器：DZF-6050型真空干燥箱、DFY-500型高速中药粉碎机、TU-1810型紫外-可见分光光度计、TGL-16G型高速台式离心机、KH-100B型超声仪、HH-8型数显恒温水浴锅、RE-4205型旋转蒸发器等，均为国产仪器；DV215CD型电子天平、OHAUS CORPORATION，美国产品。

1.2 叶绿素的提取

准确称取1 g鲜绿石楠叶子粉末，以一定料液比加入提取溶剂，在一定温度下提取一定时间，抽滤得滤液即为粗提液。

（1）料液比的影响。丙酮为溶剂，分别称取粉末1.0 g于试管中，提取温度45℃，提取时间2 h，在料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12条件下暗处密封提取。于波长645，663 nm处测定吸光度。

（2） 提取溶剂的影响。选用95%乙醇、丙酮及石油醚，80%丙酮∶石油醚（1∶1），丙酮∶乙醇∶水（4.5∶4.5∶1），乙醇∶丙酮（1∶1），95%乙醇∶80%丙酮（1∶1），80%丙酮为溶剂，分别称取粉末1.0 g于试管中，料液比1∶10，温度45℃，暗处密封放置2 h提取。于波长645，663 nm处测定吸光度。

（3）提取温度的影响。丙酮为溶剂，分别称取粉末1.0 g于试管中，料液比1∶10，提取时间2 h，分别在温度30，40，45，50，55℃下暗处密封提取。于波长645，663 nm处测定吸光度。

（4）提取时间的影响。丙酮为溶剂，分别称取粉末1.0 g于试管中，料液比1∶10，提取温度50℃，暗处密封放置1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h提取。于波长645，663 nm处测定吸光度。

1.3 叶绿素的分离纯化

选用一定吸附剂和洗脱剂湿法装柱，加入1 mL叶绿素粗提液，用一定洗脱剂进行洗脱，收集色素液，测定吸光度。

（1） 最佳吸附剂的选择。分别称取15 g硅胶、硅藻土、氧化铝、硅胶∶硅藻土=1∶1、硅胶∶硅藻土=2∶1、硅藻土∶硅胶=2∶1吸附剂，湿法装柱，加入1 mL叶绿素粗提液，用洗脱剂（石油醚∶丙酮=2∶1）进行洗脱，收集色素液，于波长645，663 nm处测定吸光度。

（2） 最佳洗脱剂的选择。称取5份15 g硅藻土，分别用石油醚∶丙酮=4∶1，10∶3，7∶3，2∶1，5∶3湿法装柱，加入1 mL叶绿素粗提液，用洗脱剂进行洗脱，收集色素液，于波长645，663 nm处测定吸光度。

（3） 最佳吸附剂质量的选择。分别称取10.0，15.0，17.5，20.0，25.0 g不同质量的硅藻土，用洗脱剂（石油醚∶丙酮=2∶1） 湿法装柱，用洗脱剂进行洗脱，收集色素液，于波长645，663 nm处测定吸光度。

（4）分离纯化的正交试验。红叶石楠叶绿色素分离的正交试验采用三因素三水平L9（34）的设计方法。

分离纯化正交试验的因素及水平见表1。

表1 分离纯化正交试验的因素及水平

1.4 叶绿素含量的测定

于波长645，663 nm处测定粗提液或纯化液的吸光度。根据Arnon公式计算叶绿素a和叶绿素b的质量浓度（mg/L），乘以相应体积数，计算每1 mL样品叶绿素质量（μg/mL）。

式中：V——定容后样品体积，mL；

n——稀释倍数；

W——红叶石楠叶片粉末质量，g。

1.5 体外抗氧化活性考查

（1） 清除·OH的能力。配制反应体系溶液（9mmol/L硫酸亚铁1 mL，9 mmol/L乙醇-水杨酸1 mL，0.003%H2O21 mL），加入上述方法纯化后的叶绿素提取液，蒸馏水作参比，以空白试剂为对照，于波长510 nm处测定吸光度。

（2） 清除O2-·的能力。将3 mmol/L邻苯三酚溶液与50 mmol/L Tris-HCl缓冲液和上述纯化后的叶绿素提取液混合，以蒸馏水为参比溶液，10 mmol/L的HCl溶液作对照，于波长325 nm处每隔30 s测定吸光度。按以下公式计算O2-·清除率。

式中：ΔA1/Δt——邻苯三酚自氧化反应速率；

ΔA2/Δt——加入色素样液后邻苯三酚自氧化反应速率。

2 结果与分析

2.1 红叶石楠叶绿素的提取效果

料液比对红叶石楠叶绿素提取效果的影响见图1，提取溶剂对红叶石楠叶绿素提取效果的影响见图2，提取温度对红叶石楠叶绿素提取效果的影响见图3，提取时间对红叶石楠叶绿素提取效果的影响见图4。

图1 料液比对红叶石楠叶绿素提取效果的影响

图2 提取溶剂对红叶石楠叶绿素提取效果的影响

图3 提取温度对红叶石楠叶绿素提取效果的影响

图4 提取时间对红叶石楠叶绿素提取效果的影响

从图1可知，在料液比1∶10时，叶绿素总含量最高，叶绿素提取效果最好；从图2可知，最佳提取溶剂为丙酮，此时叶绿素含量达到最大值，叶绿素提取效果最佳；从图3可知，随着提取温度升高，叶绿素含量逐渐增加，但提取温度高于45℃时，叶绿素含量逐渐减少；从图4可知，随着提取时间增加，叶绿素含量逐渐提高，但提取时间超过2 h，叶绿素含量逐渐减少。

按以上单因素试验选定的最优提取工艺条件（丙酮为提取溶剂，料液比1∶10，提取温度45℃，提取时间2 h）进行3批验证试验，结果表明粗提液叶绿素含量平均值可达16.42μg/mL，换算成原料石楠叶提取率约为10.26 mg/g。

2.2 红叶石楠叶绿素的分离纯化

吸附剂种类对叶绿素总含量的影响见图5，洗脱剂种类对叶绿素总含量的影响见图6，吸附剂质量对叶绿素总含量的影响见图7。

图5 吸附剂种类对叶绿素总含量的影响

图6 洗脱剂种类对叶绿素总含量的影响

图7 吸附剂质量对叶绿素总含量的影响

从图5可知，最佳吸附剂为硅藻土，此时叶绿素总含量达到最大值，叶绿素分离纯化效果最佳；从图6可知，洗脱剂为石油醚∶丙酮=2∶1的分离纯化效果最好；从图7可知，吸附剂硅藻土质量为15 g时，分离纯化效果最好。

L9（34）分离纯化正交试验结果见表2。

由表2可知，比较极差R大小，可知各因素影响次序依次为吸附剂质量、洗脱剂比例、吸附剂种类；比较同一因素不同水平的结果，可知最优条件组合是A1B3C3，此理论组合正好与正交试验中3号试验的条件组合一致，因此可以确定最佳分离纯化方案为叶绿素提取液1 mL，硅藻土17.5 g，石油醚∶丙酮为4∶1。

表2 L9（34）分离纯化正交试验结果

此时纯化倍数=99.44/16.42=6.06

式中：99.44——纯化前样品中叶绿素总含量，μg/mL；

16.42 ——纯化后样品中叶绿素总含量，μg/mL。

2.3 体外抗氧化试验结果

叶绿素清除·OH的速率见图8，不同质量浓度叶绿素清除O2-·的能力见图9。

图8 叶绿素清除·OH的速率

图9 不同质量浓度叶绿素清除O 2-·的能力

从图8可知，在一定体积内，随着叶绿素浓度的增加，其清除·OH能力先减弱后增强，当叶绿素达到一定浓度后，其清除·OH能力才会逐步增强；从图9可知，随着叶绿素质量浓度的增加，对O2-·的清除能力也在逐渐增强。

3 结论

（1）石楠叶绿素提取的最佳工艺条件为叶片粉碎度100目，以丙酮为提取溶剂，料液比1∶10，提取温度45℃，提取时间2 h，此时叶绿素提取率平均值达10.26 mg/g。

（2）石楠叶绿素粗提液分离纯化的最佳工艺条件为硅藻土17.5 g，加1 mL提取液，用石油醚∶丙酮为4∶1进行洗脱，此时纯化倍数可达6.06。

（3） 对·OH，O2-·的体外清除能力表明，红叶石楠叶绿素具有抗氧化活性。

从红叶石楠提取叶绿素具有一定的可行性和应用前景，其提取工艺条件及其抗氧化活性值得进一步研究探索。

参考文献：

[1]关锦毅，郝再彬，张达，等.叶绿素提取与检测及生物学功效的研究进展 [J].东北农业大学学报，2009，40（12）：130-134.

[2]田丽婷，马龙，堵年生.齐墩果酸的药理作用研究概况 [J].中国中药杂志，2002（12）：9-11，26.

[3]王鹏，张忠义，吴忠.熊果酸在药用植物中的分布及药理作用 [J].中药材，2000（11）：717-722.◇