外源性HGF对增龄和动脉硬化大鼠HGF和TGF-β1平衡的影响

赵晟昊 李 彤 王 凡

新乡医学院第一附属医院，河南 卫辉 453100

目前脑卒中已是中老年人的常见病与多发疾病，也是我国居民的第一大死亡原因以及首位致残因素[1-2]。脑动脉粥样硬化(cerebral atherosclerosis，CAS)是缺血性脑血管病的首要诱发因素，尤其弥漫性的小血管病变类型，目前无有效的治疗办法[3-4]。为多发性、弥漫性CAS所致的脑缺血寻找一个有效的治疗方法，以改变目前治疗方法少且效果差的现状，目前想到的是改变血运情况，但如何重建有效的血供是值得广大医学工作者深思的问题[5-6]，从而为解决老龄化社会痴呆和脑梗死预防的难题打下基础。自从“基因治疗使心脏生成新血管”被列为美国心脏学会1998年度公布的十大研究项目之首，促血管生长细胞因子促血管新生的研究便成为医学领域关注的热点[7-8]。从2005年至今，《Nature》《Science》《Cell》等有关脑血管形成的分子机制研究始终引领本学科的前沿领域。诸多相关基因的功能与信号转导机制在胚胎脑血管发生中的发现，为成年脑血管新生机制的研究奠定了理论基础[9]。Ad-HGF目前已经进入临床Ⅲ期试验，并在心肌缺血和骨骼肌缺血治疗并获良好评价，目前，与HGF关系密切并具有明确相互作用的是TGF-β1[10-11]。

本实验通过向老龄CAS大鼠蛛网膜下腔中注入外源性Ad-HGF，观察其促脑血管新生的作用，采用ELISA法分析CAS大鼠脑脊液中HGF和TGF-β1含量，采用免疫组化和免疫印迹法分析脑组织中HGF和TGF-β1含量，探讨HGF、TGF-β1相互间作用关系与大鼠老龄和CAS的相关性。

1 材料和方法

1．1主要材料Ad-HGF(携带人HGF基因的重组腺病毒，滴度为5×109pfu/100 μL，北京奥洛英)，Westernblot试剂盒(碧云天)，鼠抗HGF单克隆抗体，鼠抗TGF-β1单克隆抗体，Western blot试剂盒，人HGF及鼠TGF-β1的ELISA检测试剂盒(南京森贝伽)，胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、猪油、蛋黄粉、蔗糖(北京索莱宝)，手术显微镜，大鼠脑立体定位仪，微型手持式颅钻，25 μL微量注射器，ML125鼠尾无创血压测定仪，Powerlab生理信号采集与处理系统(Powerlab/8SP Australia)，奥林帕斯AU2700全自动生化分析仪。

1．2动物模型建立SPF级18月龄雄性SD大鼠30只，体质量300～400 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司[动物生产许可证：SCXK(京)2012-0001，实验动物设施使用许可证：SYXK(豫)2014-0005]，随机分为对照组(n=15)和脑动脉硬化模型组(CAS，n=15)。采用高血压合并高脂饲料喂养制备脑动脉硬化动物模型，造模方法按有关文献[12]处理，造模处理后凡血压较处理前高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上且高于115 mmHg认为形成高血压模型[13]。大鼠喂养16周后，模型组TC、TG、LDL-C水平均明显高于正常组，差异有统计学意义。模型组随机取大鼠5只，常规腹腔麻醉后，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液经心脏灌注后，断头取颈内动脉终段(约0.5 cm)，制成石蜡切片并进行HE染色，光镜下观察颈内动脉血管病变。颈内血管形态学观察到血管内皮表面粗糙凹凸不平，细胞排列不规整，大量泡沫细胞堆积，血管内膜增厚显著，形成典型的AS斑快，提示CAS造模成功。

1．3药物处理建模成功后，另用40只造模大鼠随机分为模型组、模型Ad-HGF组各20只；模型Ad-HGF组20只大鼠5×109pfu/mL，0.05 mL的Ad-HGF经小脑延髓池注射入蛛网膜下腔中。模型组大鼠20只，经小脑延髓池注入蛛网膜下腔注射0.05 mL生理盐水。1月龄雄性SD大鼠40只，随机抽取20只经小脑延髓池注入蛛网膜下腔中，注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF。另取40只1月龄大鼠，随机抽取20只经小脑延髓池注入蛛网膜下腔5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只经小脑延髓池至蛛网膜下腔注射0.05 mL生理盐水。6月龄雄性SD大鼠40只，随机抽取20只经小脑延髓池注入蛛网膜下腔注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只经小脑延髓池注入蛛网膜下腔0.05 mL生理盐水。12月龄雄性SD大鼠40只，随机抽取20只经小脑延髓池至蛛网膜下腔注射5×109pfu/mL，0.05 mL Ad-HGF，另外20只经小脑延髓池注入蛛网膜下腔0.05 mL生理盐水。

1．4 实验方法

1．4．1 ELISA法测定脑脊液中HGF和TGF-β1浓度

1．4．1．1 脑脊液的采集：将大鼠麻醉后，再将头部固定于立体定位仪上，头颈部剃毛、消毒干净后，用手术刀在后颈部作一3 cm纵向切口，轻轻分离颈部背侧的肌肉。术中及时止血，在暴露出枕骨大孔后。将大鼠头部压低，垂直由枕骨大孔向内进针抽取脑脊液，注意勿插入过深。抽完后缝好里面肌肉及外面皮肤，用干净纱布包扎伤口，防止感染。采集脑脊液后，应注入等量的生理盐水，以维持原有颅内的压力。最后将脑脊液移入1.5 mL的EP管中，放入液氮或干冰中迅速冷冻后移入-80 ℃中保存备用。

1．4．1．2 ELISA检测实验步骤：依试剂盒所提供的方法，严格进行ELISA检测。配置2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 pg/mL的标准品各0.1 mL，每孔加入100 μL标准品或待测脑脊液。另设零孔2个，酶标板加上盖，37 ℃反应90 min。反应后用力甩尽酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗。将准备好的生物素一抗工作液以每孔0.1 mL的标准依次加入(TMB空白显色孔除外)孔内，温箱内37 ℃下反应60 min。然后用PBS液洗涤酶标板3次，每次浸泡1 min以上。再用试剂盒中的ABC工作液按每孔0.1 mL的标准依次加入(TMB空白显色孔除外)各孔中，温箱内37 ℃下反应30 min，然后重复前面洗板工作。最后每孔依次加入等量的TMB显色液，温箱内37 ℃下避光反应30 min。最后每孔依次加入TMB终止液1滴并混匀，用酶标仪在450 nm处测吸光值OD。结果计算与判断：以零孔为对照，测得的数据以吸光值OD作为纵坐标，以浓度作为横坐标，在电脑中绘制出标准曲线，计算样品含量。

1．4．2 Western印迹检测：取-80 ℃冰箱内保存的各组大鼠的脑皮质，每组80 mg，用液氮研磨后分别加入蛋白裂解液后离心、取上清液，BCA法测定各组蛋白质浓度，每个样品上样80 μg，按总的蛋白质量计算各样品所需体积，需配平体积，再加入3倍Buffer煮沸5 min。再用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，转移至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后加入HGF或TGF-β1一抗，一抗浓度均为1：1 000，在4 ℃下孵育过夜。第2天室温下复温60 min，用TBST洗膜3次，每次10 min以后，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗(浓度均为1：2 000)，室温摇床上孵育2 h，再加入DAB显色液在凝胶成像系统中进行曝光和图像分析，用Image Q软件分析蛋白质条带，并计算出各个条带的面积与灰度值大小，计算二者乘积为积分灰度值，取3次重复测定值的均数。

1．4．3 观察指标：采用ELISA法测定各组大鼠脑脊液中HGF、TGF-β1的动态变化。采用Western blotting测定各组大鼠脑组织中HGF、TGF-β1蛋白杂交条带，与内参进行相对密度扫描求OD值。

1．5统计学处理应用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，对于符合方差分析应用条件的，组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用最小显著性差异(LSD)检验；不满足方差分析条件时，组间多重比较采用Dunnett’s T3检验。假设检验统一使用双侧检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1脑脊液中HGF、TGF-β1浓度未打入Ad-HGF组大鼠脑脊液中均未检测到HGF，打入Ad-HGF组可在脑脊液中可检测到HGF浓度。经Dunnett’s T3法组间多重比较，打入Ad-HGF组脑脊液HGF浓度值均高于未打入Ad-HGF组，差异均有统计学意义(P<0.05)，脑脊液HGF浓度值随年龄增加而降低，脑脊液HGF浓度值未打入Ad-HGF组间比较差异无统计学意义，打入Ad-HGF组间比较差异无统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同时间点各组大鼠脑脊液HGF浓度比较

经Dunnett’s T3法组间多重比较，打入Ad-HGF的组别脑脊液TGF-β1浓度值均高于未打入Ad-HGF的组别，差异均有统计学意义(P<0.05)；脑脊液TGF-β1浓度值随年龄增加而增加，各组内不同时间比较，经one way ANOVA分析，未打入Ad-HGF的组别脑脊液TGF-β1浓度值随时间变化差异无统计学意义，3个年龄Ad-HGF组脑脊液TGF-β1浓度值随时间变化差异有统计学意义，经LSD法组间多重比较，TGF-β1浓度第20天组低于第10天和第30天组(表2)。

表2 不同时间点各组大鼠脑脊液TGF-β1浓度比较

2．2 Western blotting法检测脑组织HGF、TGF-β1蛋白表达未打入Ad-HGF的组别大鼠脑组织中只有较少HGF表达，打入Ad-HGF的组别脑组织可见HGF表达增多，同一时间点打入Ad-HGF的组别均较未打入Ad-HGF的组别有明显增加。经Dunnett’s T3法组间多重比较，未打入Ad-HGF的模型组HGF OD值高于未打入Ad-HGF的增龄组，差异无统计学意义(P>0.05)。打入Ad-HGF的增龄组HGF值随年龄增加而降低，经LSD法组间多重比较，第20天组高于第10天和第30天组(图1，表3)。

未打入Ad-HGF增龄组大鼠脑组织中TGF-β1表达较少，但在未打入Ad-HGF的模型组大鼠脑组织中TGF-β1明显增加。打入Ad-HGF组脑组织可见TGF-β1表达减少。TGF-β1 OD值随年龄的增加呈正相关(表4)。各组内不同时间之间比较，经one way ANOVA分析，未打入Ad-HGF增龄组大鼠脑组织中TGF-β1 OD值随时间变化无差异，未打入Ad-HGF的模型组和3个年龄Ad-HGF组脑组织中TGF-β1 OD值随时间变化有差异，经LSD法组间多重比较，第20天组低于第10天和第30天组(P<0.05，图2，表4)。

表3 不同时间点各组大鼠脑组织中HGF OD值比较

表4 不同时间点各组大鼠脑组织中TGF-β1 OD值比较

图1 Western blotting HGF蛋白表达 A：1月组；B：6月组；C：12月组；D：1月Ad-HGF组；E：6月Ad-HGF组；F：12月Ad-HGF组；G：模型组；H：模型Ad-HGF组

图2 Western blotting TGF-β1蛋白表达 A：1月组；B：6月组；C：12月组；D：1月Ad-HGF组；E：6月Ad-HGF组；F：12月Ad-HGF组；G：模型组；H：模型Ad-HGF组

3 讨论

本实验将外源性HGF打入3组增龄大鼠组，发现随着年龄的增加，HGF水平逐渐降低，随年龄增加，TGF-β1水平逐渐升高。而将外源性HGF打入老龄脑动脉粥样硬化模型大鼠后，随着动脉硬化程度加深，机体内HGF水平逐渐增加，TGF-β1水平却逐渐降低。说明HGF与动脉硬化程度呈正相关，与年龄呈负相关，TGF-β1与动脉硬化程度呈负相关，与年龄呈正相关。HGF、TGF-β1水平随年龄变化呈动态互逆平衡，HGF、TGF-β1水平随脑动脉硬化程度呈动态互逆平衡。

HGF 的快速诱导表达在遥远的完整器官中很常见，如肝、肾、肺、脾，以及在受伤在大鼠缺血再灌注损伤后的心及大脑中[14]，表明内源性HGF可能来自这些器官。在肝、肾损伤大鼠血浆中，也有体液因子诱导HGF的表达[15]。转化生长因子β1可以由急性和慢性脑损伤引起，包括卒中、外伤、癫痫、多发性硬化症和阿尔茨海默病[16]。转化生长因子β1在不同类型的脑损伤中表达是不一样的，不同类型脑损伤时，TGF-β1有不同对应：卒中时TGF-β1的mRNA至少升高1周以上，明确发挥保护神经细胞的作用[17]。有文献报道，卒中时TGF-β1过度表达[18-20]；当TGFβ信号被阻断，缺血损害加剧[21]。因此，它可能是一种有效的卒中治疗剂。

HGF、TGF-β1之间相互的平衡，参与确定的慢性器官疾病的预后，如脑梗死、肝硬化、肾硬化和肺纤维化[22-23]。在慢性疾病的早期阶段，HGF生产增强抑制TGF-β1产生。一般来说，HGF只在细胞再生和抗肝纤维化事件中作为代偿反应发生[24-25]。相比之下，在晚期TGF-β1表达的上调抑制HGF的表达[26]。在TGF-β1占主导地位的条件下，容易导致器官纤维化的发生和器官发展为功能障碍。为扭转这种不利的平衡，根据这种发病机制，所以用HGF治疗器官的功能衰竭以及纤维化(及增生)应视为一种新策略[27-29]。

本实验通过建立增龄及动脉硬化模型大鼠实验，探讨了脑组织和脑脊液中HGF和TGF-β1含量变化与年龄以及动脉硬化的关系，初步显示HGF-TGF-β1平衡在老龄以及脑动脉硬化发生、发展中的神经保护和血管形成过程中的作用，明确外源性Ad-HGF应用于中枢神经系统的有效性和不良反应。本实验对Ad-HGF应用于脑动脉硬化临床提供了科学依据，对脑血管病的防治提供了一种新的治疗方法和研究方向，也为神经康复治疗提供一个新途径。

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