‘高原红’海棠花粉特性与生活力测定研究

李千惠，张丹丹，姜文龙，薛 源，张往祥,2，王改萍*

(1. 南方协同中心,南京林业大学林学院，江苏 南京 210037； 2. 扬州小苹果园艺有限公司，江苏 扬州 225200)

观赏海棠(Malussp.)为蔷薇科(Rosaceae)苹果属植物，传粉方式为典型的异花虫媒传粉。通过长期的高度杂合，观赏海棠已被培育出许多受欢迎的品种[1]，在美国和加拿大的园林景观植物名录中，可以见到的海棠栽培种就有500个以上[2]。现有观赏海棠重要特征的多样化为培育期望值更高的新品种提供了更广的范围。观赏海棠的花期，根据气候的不同，约从3月底开始至5月初结束，可达30 d左右，而单个品种的花期范围为3—7 d，因此，很多亲本组合的杂交受到时间上的阻隔。

花色及果色的鲜艳亮丽且不褪色，是观赏海棠的重要观赏特征。‘高原红’(M. ‘Prairifire’)作为兼具以上特点的品种之一，更有花量、果量均较大的优势，为绝佳的杂交亲本品种。将这种特征传授给其他花形优美却褪色的品种如白兰地(M. ‘Brandymine’)，则会受到不同花时的影响，而花粉寿命及其质量也会直接影响着授粉的结果[3]。因此，掌握花粉的贮藏特性，是合理开展杂交育种的基础。目前，对一些树种花粉的研究，涉及对在不同的贮藏条件下的花粉活力的测定，贮藏方法的优化，以及对花粉进行短期或长期的储存[4-6]。花粉活力受温度等诸多外在因素的影响，也因自身遗传特性而异[7]。低温能延长花粉的贮藏期限，大多数植物在-20 ℃即可保持其生活力[8]。Perveen等研究了不同贮藏温度下的苹果花粉，发现相比4 ℃下贮藏的花粉，在-196 ℃温度下贮藏的萌发率更高[9]。然而多数研究关注零上温度与超低温之间对花粉贮藏效果的影响，在小温度差对花粉贮藏影响的区别研究上鲜有报道。因此，本研究基于4种贮藏温度(4，-20，-70 ℃及室温)下观测花粉萌发率的动态变化，开展了小温差对花粉贮藏的影响及区别研究，探讨了观赏海棠花粉短期贮藏的适宜温度。

1 材料与方法

1．1 试验地概况与试验材料

试验地位于江苏省江都市仙女镇(东经 119°55′，北纬 32°42′)南京林业大学海棠种质资源圃，属于北亚热带季风气候，四季分明。年平均气温约 14.9 ℃，年平均降雨量约 1 000 mm，无霜期约320 d。试验地地势平坦，立地条件一致，土壤为沙壤土，土层深厚肥沃，灌排条件良好。

选取‘高原红’5年生健壮无病虫害实生苗作为试验材料。

1.2 花粉采集方法

于8:00—10:00采集高原红盛花期花朵，放入硫酸纸袋中，迅速带回实验室，用镊子将花药取下后，将其摊在硫酸纸袋上，置于避风干燥处自然散粉，待完全散粉后用离心管收集花粉，备用。

1.3 扫描电镜观察

取海棠高原红适量花粉于40 ℃干燥14 d后，直接将花粉撒在粘有双面胶的样品托上，真空喷镀，置于KYKY-1000B型扫描电子显微镜下观察，选取较为典型的花粉粒，在2 000—6 000 倍显微下拍照。主要观察花粉形状，对称性，赤道面观特点，萌发孔，外壁纹饰等特征。将拍得数码照片导入电脑后用DT2000图像分析软件对随机选择的100粒花粉，进行其极轴长(P)、赤道轴长(E0)、赤道轴到2端点中间横截面的直径(E1/2)及萌发孔长宽的测定。

1.4 荧光显微观察

分别采集授粉后(高原红♂×白兰地♀)8，12 h的雌蕊各10个(花柱和子房)，用FAA固定液(75%乙醇∶甲醛∶冰醋酸=89∶6∶5，体积比)固定，然后进行低温保存备用。

取出固定的样品装入10 mL离心管中，用50%，30%酒精溶液及清水依次分别清洗3次，贴上标签，加入10 mol/L的NaOH溶液软化8 h，随后用0.15 mol/L水溶性苯胺蓝置于暗处染色12 h。染色完成后，用镊子取出样品，置于载玻片上，用镊子、解剖针和刀片将子房和花柱分开，然后将子房和柱头分别压片，使其能在玻片上充分展开，点上50%甘油封片，置于暗处待观察。用LeicaDM-5000 B荧光显微镜观察，并记录拍照。

1.5 花粉贮藏条件

将采集的花粉分别置于4种条件下 (4，-20，-70 ℃及室温) 贮藏，其中4 ℃和-20 ℃贮藏冰箱为SIMENS BCD-277冰箱，-70 ℃贮藏冰箱为SANYO MDF-U32V超低温冰箱。

1.6 花粉生活力测定

花粉培养采用液体培养法[10]，在双凹载玻片上滴加50 μL液体培养基(10%蔗糖溶液)，用大头针蘸取适量花粉，使其均匀地散落在培养基上，将载玻片水平置于铺有湿润脱脂棉的培养皿内，在25 ℃条件下保湿培养。用NIKON YS100光学显微镜观察，每个玻片随机选取5个不重复的视野，统计萌发率，花粉管长度大于花粉直径视为萌发，测定花粉管长度(如图3E)。各试验均重复4次。

萌发率=(已萌发花粉数/花粉总数)×100%

1.7 数据分析

对高原红花粉萌发试验的不同贮藏条件花粉管生长速率，以DPS软件采用Duncan进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜观察

花粉粒P值为(45.57±2.92) μm，E0值为(23.91±4.96) μm，E1/2值为(20.61±5.83)μm，反应花粉相对大小的P×E0为(1 090.12±6.76)μm；花粉极面观为3裂圆形，赤面观为长球形，P/E0为(1.91±4.72)μm，P/E1/2为(2.22±6.40)μm，E1/2/E0为(0.86±4.43)μm；花粉条脊宽(0.18±11.06)μm，条脊距(0.21±42.10)μm，条脊较长且较清晰，分叉多，纹饰特征为局部规则多个方式型(PRM，100)。穿孔密度(9.31±24.01)个/μm2，分布不均匀且赤面较多，穿孔大(见图1)。

(A) 赤面双沟；(B) 极面观；(C) 赤面纹饰；(D) 群体

2.2 花粉离体萌发培养基筛选

从表1可以看出，蔗糖在海棠花粉离体萌发中有着重要的作用，适宜的蔗糖质量分数(10%)可使高原红花粉的离体萌发率高达89.7%，过高或过低都会极显著地降低其萌发率(P<0.01)。而在仅含有H3BO3的培养基中，随着H3BO3浓度的升高，花粉萌发率表现出下降的趋势，说明H3BO3的存在对高原红花粉的萌发有一定程度的抑制作用，当H3BO3浓度为0.3 mol/L时，花粉萌发率降低至0；当H3BO3浓度为0.2 mol/L时，其萌发率与CK下差异不显著。说明在小于0.2 mol/L的H3BO3浓度范围内，相对于CK，硼酸也在一定程度上促进了花粉的萌发。新鲜花粉离体萌发的结果显示，在10%的蔗糖溶液中及25 ℃的培养温度下，高原红花粉培养4 h的萌发率为92.7%，平均花粉管长度可达2.26 mm(见图2)。

表1 不同培养基成分对花粉离体萌发率的影响

2.3 ‘高原红’海棠活体萌发状况

新鲜‘高原红’花粉在白兰地柱头的萌发试验结果表明，授粉后第8 h时，花粉的萌发率较低，且花粉管并未伸长到花柱中部，而在授粉后第12 h时，花粉管则在柱头大量萌发，且花粉管已经伸长花柱中部至基部，说明高原红花粉在白兰地柱头萌发时，授粉后8—12 h是花粉管在花柱的快速伸长期。

2.4 花粉贮藏过程中的活力变化

花粉贮藏试验结果表明，随着贮藏时间的延长，4种温度下贮藏的花粉，其萌发率及平均花粉管长度均呈现出不同程度的降低和减小(见图2，3)。室温(17—20 ℃)贮藏的花粉，在第10 d时，其离体萌发率即降低为0，4 ℃下贮藏的花粉萌发率则在第30 d时降低为0，比室温贮藏的时间增加了200.0%，且当室温贮藏花粉的离体萌发率降低为0时，4 ℃贮藏的花粉萌发率与平均花粉管长度仍然可达到39.8%和0.94 mm。然而，在-20 ℃与-70 ℃下贮藏的花粉在保存的第30 d萌发率仍然能够分别达到31.3%和39.2%，平均花粉管长度则分别为0.3 mm和0.45 mm，且在整个贮藏过程中，-70 ℃下贮藏的花粉萌发率均持续显著高于其他温度下贮藏的花粉(P<0.05)。而在贮藏的第2 d时，4 ℃与-20 ℃温度下贮藏的花粉萌发率差异不显著；贮藏至第4 d时，4 ℃下贮藏的花粉萌发率为72.54%，相对-20 ℃下贮藏的花粉，仅降低了4.1%。

图2 不同贮藏温度下的花粉离体萌发率及花粉管长度

A，B，C，D分别为室温，4，-20，-70 ℃条件下保存10 d的花粉萌发情况；E，F显示视为萌发的花粉(GP)、视为未萌发的花粉(UGP)与花粉管在10×视野下的状态

3 讨论

Stanley等认为花粉离体萌发法提供的条件与花粉在柱头萌发的条件更为接近，是检测花粉活力最为可靠的方法[11]。离体萌发测定法根据花粉离体培养时的萌发率判定其生活力，要在一定的温度和培养条件下进行，操作简单，迅速，合理，并可完全定量。蔗糖和硼酸是在花粉离体萌发时所需培养基的主要成分[12-13]。蔗糖是大多数植物花粉离体培养所必需的更为重要的培养成分[14-15]，其能在花粉离体培养时为花粉管的生长提供营养物质和花粉萌发所需的渗透压[16]；硼酸作为花粉离体萌发的另一重要因素，对花粉离体萌发同样有着较为重要的作用，在离体培养条件下，适宜的硼酸处理可以有效提高花粉萌发率[17-19]。本研究结果表明，适宜的蔗糖质量分数(10%)能够显著促进花粉的萌发，不同质量分数蔗糖在花粉的萌发中有显著差异；硼酸浓度对花粉萌发有显著影响，花粉萌发率随着硼酸浓度的升高而显著下降，当硼酸的浓度为0.05 mol/L时，‘高原红’花粉的萌发效果最好，这可能是由于‘高原红’花粉适宜的硼酸浓度在0—0.05 mol/L之间。以上结果说明，一定质量分数的蔗糖或者硼酸能够促进‘高原红’花粉的萌发，过高则会起到抑制萌发的作用。

除本身的遗传基因外，环境条件是花粉耐贮藏性的另一重要影响因素[20]，许多研究表明，贮藏温度是保存花粉寿命的关键因子之一[21-23]，适宜的低温条件较利于花粉的贮藏。本试验结果表明，在花粉贮藏过程中，室温(17—20 ℃)下贮藏的花粉活力急速下降，花粉管长度与4，-20，-70 ℃差异显著(P<0.01)，4 ℃下贮藏的花粉离体萌发率同样呈现急速下降的趋势，与-20,-70 ℃差异显著(P<0.01)，而-20 ℃与-70 ℃下贮藏的花粉其离体萌发率差异不显著，而超低温(-70 ℃)下贮藏的花粉取出时若处理不当容易出现冻融现象，因此，-20 ℃更适合‘高原红’花粉的保存。

综上所述，适宜的硼酸浓度在0—0.05 mol/L，‘高原红’花粉离体萌发的适宜培养基成分为10%蔗糖溶液，并与活体萌发相比较，发现离体萌发较快于活体萌发，且活体萌发中花粉管在授粉后第8—12 h为快速伸长期；‘高原红’花粉适宜的贮藏温度为-20 ℃。

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