铁线莲‘Avant-Garde’组织培养及快速繁殖试验

黄 婧，张 敏，周 鹏，周 洁，蒋泽平

(江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153)

铁线莲(ClematisfloridaThunb.)是毛茛科(Ranunculaceae)铁线莲属植物，多数为落叶或常绿草质藤本，有“藤本皇后”的美称。在我国主要分布于广西、广东、湖南、江西等地区[1]。生于阳光充足、湿润、开阔的地方，喜肥沃、排水良好的碱性壤土。铁线莲的花期从早春到晚秋，果期夏季，花色艳丽，花形独特，具有较高的观赏价值[2]。此外，铁线莲一直作为传统中药材使用，根和全株都可入药[3]。国外对铁线莲的培育驯化工作开展较早，引进观赏性较强的国外品种，可以扩大铁线莲属植物的应用范围，也能促进我国铁线莲属植物育种事业的发展。欧洲的铁线莲品种‘Avant-Garde’属于晚花大花型(Late Large-flowered Group)类群，有很高的观赏价值和经济价值。花红色，大而漂亮。花朵星形，花瓣深粉红色，花朵中部为重瓣花，浅粉红色，花药黄色。‘Avant-Garde’的种子繁殖非常困难，只能采用无性繁殖手段，扦插繁殖的成活率较低，采用组织培养技术可以有效地解决这些问题。本试验研究了铁线莲品种‘Avant-Garde’的组织培养技术，包括茎段增殖和瓶内生根的培养基配方选择，以期为产业化生产和推广应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1．1 材料处理

剪取当年生嫩茎10 cm左右，用自来水清洗，接着用洗洁精浸泡10 min，再用自来水冲洗干净。放置于超净台内的无菌瓶中，用1%次氯酸钠溶液浸泡消毒10 min，再用纯水冲洗干净。经表面消毒后的茎段用灭过菌的滤纸吸干，切成1 cm左右的具节茎段待用。

1.2 培养基设计

1.2.1 基本培养基筛选 将表面消毒后的茎段作为外植体，切下接种在培养基中，每个处理10瓶，每瓶接种茎段4个，重复3次。基本培养基配方是MS和WPM。每种培养基附加3%(30 g/L)的蔗糖，0.6%(6 g/L)的卡拉胶，pH5.8。20 d后统计出芽外植体数和诱导的腋芽数。

1.2.2 增殖培养 以具节茎段为外植体，接种在诱导培养基中，每个处理10瓶，每瓶接种茎段4个，3次重复。选择筛选出的较适宜基本培养基进行增殖培养，按照处理组合(见表1)添加不同质量浓度的NAA和6-BA，附加3%(30 g/L)的蔗糖，0.6%(6 g/L)的卡拉胶，pH5.8。20 d后统计新出的不定芽数，计算增殖系数。增殖系数=不定芽总数/诱导出不定芽的外植体总数。

表1 增殖培养基中植物生长调节剂 mg/L

1.2.3 生根培养 将新生的无菌苗切取3—4 cm左右的带顶芽茎段作为生根苗，接入生根培养基中，每个处理10瓶，每瓶接种茎段1个，重复3次。生根培养基的配方以1/2 WPM作为基本培养基，按照处理组合(见表2)添加不同质量浓度的NAA和IBA，附加3%(30 g/L)的蔗糖，0.6%(6 g/L)的卡拉胶，pH 5.8。20 d后统计生根幼苗数量，计算生根率。

表2 生根培养基中植物生长调节剂 mg/L

1.3 组织培养条件

光照时间12 h/d，光照强度1 000 lx，温度(20±2) ℃，相对湿度60%。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0对试验数据进行统计和分析，对增殖系数和生根数量进行方差分析和Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对具节茎段生长的影响

在不加任何植物生长调节剂的MS培养基和WPM培养基上接种铁线莲具节茎段，接种20 d后，对茎段生长情况和出芽外植体数进行了调查，结果见表3。铁线莲茎段在2种培养基上都能被100%诱导出芽，茎段在WPM培养基中的诱导腋芽数多于在MS培养基中的数量。同时，通过肉眼观察发现，在WPM培养基中生长的茎段更粗壮(未测量茎段粗度)，颜色更绿。由此，选择WPM培养基为基本培养基，进行后续的增殖和生根培养。

表3 不同培养基对腋芽诱导的影响

2.2 不同植物生长调节剂对具节茎段增殖的影响

在WPM培养基上添加不同质量浓度的NAA和6-BA进行增殖培养基筛选，培养20 d后进行调查。从表4中可见，不同植物生长调节剂组合处理对铁线莲的继代增殖有较大影响，增殖系数从1.41至2.83不等。方差分析(见表5)显示，不同质量浓度的6-BA处理之间有极显著差异(P< 0.01)，而不同质量浓度的NAA处理间没有显著差异(P> 0.05)。具体而言(见表6)，6-BA的3个质量浓度(0.5，1.0 mg/L和2.0 mg/L)之间有显著差异(P< 0.05)，其中，1.0 mg/L的处理与另外2个质量浓度的处理相比，有极显著差异(P< 0.01)。从数据的平均值来看，当6-BA为1.0 mg/L时，增殖系数最高，平均值为2.66，所以最佳增殖培养的6-BA质量浓度是1.0 mg/L；此外，当6-BA为2.0 mg/L时，增殖系数最低，平均值为1.47，而其他2个质量浓度的增殖系数较高。这可能是由于较高质量浓度的6-BA在一定程度上抑制了茎段芽苗的生长。同时，随着NAA质量浓度的上升，增殖系数呈现先上升后下降的趋势，当NAA质量浓度为0.1 mg/L时，增殖系数最高，平均值为2.13，所以最佳增殖培养的NAA质量浓度是0.1 mg/L。因此铁线莲品种‘Avant-Garde’的最佳增殖培养基配方为WPM+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

表4 不同植物生长调节剂对茎段增殖培养的影响

表5 增殖系数的方差分析结果

表6 增殖系数的Duncan检验

2.3 不同植物生长调节剂对幼苗生根的影响

通过添加不同质量浓度的植物生长调节剂来刺激幼苗在组织培养瓶内生根，结果统计见表7。处理B3中生根数最多，生根率达到50.00%；其次是处理B6，B2和B9，生根率分别为43.33%，40.00%和40.00%。方差分析(见表8)显示，每种植物生长调节剂的不同质量浓度处理间都存在极显著差异(P< 0.01)。Duncan检测结果显示(见表9)，NAA的3种质量浓度水平之间存在显著差异(P< 0.05)，其中，0.15 mg/L与另外2种质量浓度处理之间有极显著差异(P< 0.01)。生根幼苗数量随着NAA质量浓度升高而增加，当质量浓度为0.15 mg/L时，幼苗生根数量最多，平均12.25个，由此认为诱导生根的NAA最适合质量浓度为0.15 mg/L。IBA在0.2 mg/L水平与其他3种质量浓度之间，有极显著差异(P< 0.01)，且生根幼苗数量随着IBA质量浓度升高而减少，在0.2 mg/L时，生根幼苗数量最多，平均12.67个，由此认为诱导生根的IBA最适合质量浓度为0.2 mg/L。因此铁线莲品种‘Avant-Garde’的最佳生根培养基配方为1/2 WPM+0.15 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA。

表7 不同植物生长调节剂对生根培养的影响

表8 幼苗生根数量的方差分析结果

表9 生根数量的Duncan检验

3 结论与讨论

本试验对适合铁线莲品种‘Avant-Garde’生长的增殖培养基和生根培养基进行了筛选，并对培养基中的不同植物生长调节剂质量浓度进行了比较分析，最终获得的最适增殖培养基配方是WPM+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，增殖系数达到2.83；最佳生根培养基配方为1/2 WPM+0.15 mg/L NAA +0.2 mg/L IBA，生根率达到50%。

经过比较试验，发现铁线莲品种‘Avant-Garde’在WPM培养基上生长状态更好，所以选择WPM培养基为基本培养基。根据前人的研究[4-6]，发现不同的植物生长调节剂配比会对铁线莲的组织分化、生根诱导和次生代谢产生不同的影响。试验中发现，6-BA的质量浓度过高会使幼苗基部的愈伤组织膨大、腋芽的生长速率变慢，这与前人研究的结果类似[7-8]。这说明6-BA具有促进植株芽生长和诱导愈伤组织的双重功能，在今后应该根据培育目标采用合适的用量。

课题组前期的试验结果发现，铁线莲品种‘Avant-Garde’的扦插成活率较低(数据未发表)，需要进行瓶内生根培养。瓶内生根技术可以使组织培养苗逐步适应外部环境，为幼苗成功移植到瓶外环境奠定基础，目前这种技术已经在铁线莲和许多其他植物中得到良好的应用[9-11]。生根培养需要降低培养基中的矿物元素浓度，减少幼苗体内积累的细胞分裂素，并加入适当的生长素。因此，本试验在生根阶段采用1/2 WPM作为基本培养基，去掉细胞分裂素6-BA，并根据前人的研究经验[12-14]，加入不同质量浓度的生长素IAA和NAA诱导铁线莲生根。当NAA质量浓度为0.15 mg/L，同时IBA质量浓度为0.2 mg/L时，生根效率最高，可达到50%。今后，需要研究分析铁线莲‘Avant-Garde’扦插生根和组织培养瓶内生根过程中的植物生长调节剂水平、次生代谢和基因表达的异同，找出该品种生根困难的原因，提高品种的生根率、生根速度和移栽成活率。

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