具杀松材线虫活性细菌的筛选和鉴定

曾丽琼，何学友，蔡守平，黄金水

(福建省林业科学研究院/国家林业局南方山地用材林培育重点实验室，福建 福州 350012)

松萎蔫病又名松材线虫病，是由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引发的一种森林病害，属国际重要检疫对象，列为森林病虫害之首[1]，被称为“松树的癌症”[2-3]。该病靠媒介松墨天牛(Monochamusalternatus)携带传播，使用化学药剂可以有效控制松褐天牛，但化学药剂造成的环境污染对生态平衡带来越来越明显的负面影响。随着人们环境意识的增强，对植物寄生线虫生物防治细菌的研究逐渐兴起，应用细菌防治植物寄生线虫的工作己经取得了诸多进展。研究人员对于利用细菌作为松材线虫防治制剂的报道，多见于对具有杀松材线虫活性细菌的筛选，如牛秋红、郑海营等[4-5]分别从土壤和海水中分离筛选出对松材线虫具有较强杀线虫活性的细菌。内生细菌作为最具防病潜力与应用价值的一类生物防治细菌，是植物病害生物防治的天然资源菌，其广阔的理论研究价值和开发应用前景，成为许多学者研究的热点对象[6-8]。马尾松作为松材线虫的寄主，从其本身分离筛选对松材线虫活性有抑制作用的细菌，是理性控制松材线虫病的途径，但是对于从松树上分离的内生细菌的研究报道较少，仅见朱丽梅、邓海娟、李亮亮等[9-11]的报道。本研究开展了对马尾松内生细菌分离和对松材线虫杀线活性的测定研究，筛选出具有较强抑制线虫活性的细菌，并对筛选到的菌株进行初步鉴定，以期为微生物防治和开发植物寄生线虫生物防治制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2014年11月，2015年3，6和9月分别选取在松材线虫疫区健康生长的马尾松枝条作为分离材料的来源。树龄为6—7年生，采样时将枝条放入灭菌的纸袋中带回实验室进行内生细菌分离。松材线虫来源于疫区枯死木，采用贝曼漏斗法分离后在多毛孢平板中培养备用。

1.2 内生菌分离

取松树嫩梢松针、枝条，依次用无菌水冲洗表面，75%乙醇消毒30 s、10%NaClO消毒5 min，再在无菌水中漂洗4次，用消毒枝剪剪成小段，放入装有2 mL无菌水和少许灭过菌的石英砂的无菌研钵，将其研磨成匀浆后，静置5 min。用移液枪吸取150 μL于NA平板中涂板，28 ℃下培养。待长出菌落后，观察生长细菌菌落的状况。同时检查检验表面消毒的效果，方法为吸取150 μL第4次漂洗消毒材料的无菌水，涂平板，经培养后若无微生物长出，证明表面消毒彻底。3—7 d，待长出菌落后，对不同单菌落的颜色、大小、突起特征、边缘特征、表面光滑与否和透明度等的特征进行描述，并根据菌落的形态、颜色和大小选取分离到的菌株，在平板上进行纯化保存。

1.3 内生细菌杀线虫活性测定

将保存的菌株在NA平板上活化后接种到NA培养液中，28 ℃条件下160 r/min培养48 h，取2 mL细菌发酵液至离心管中，经 5 000 r/min离心5 min，取上清液，用滤膜孔径为0.22 μm的细菌过滤器过滤，取900 μL滤液分装到24孔细胞培养板的样品孔中，以不接菌的NA培养液滤液为对照，加入线虫悬液100 μL(50 000 条/mL)混匀，每个处理重复3次，25 ℃下慢速振荡培养，分别在处理24和48 h后观察并统计线虫死亡数，观察时取100 μL(观察的线虫总数不少于30头)点到载玻片上，在10倍光学显微镜下计数死亡线虫数及线虫总数(线虫死亡标准是虫体僵直，用解剖针搅动或接触刺激时仍不活动视为死亡[12-13])。毒力级别划分参照万树青[14]方法，即Ⅰ级：死亡率≥90%；Ⅱ级：70%≤死亡率<90%；Ⅲ级：50%≤死亡率<70%；Ⅳ级：30≤死亡率<50%；Ⅴ级：10≤死亡率<30%；Ⅵ代表无杀线活性。

1.4 高活性菌株的鉴定

对得到的高活性菌株进行形态观察，革兰氏染色和KOH拉丝试验按照常规方法进行。细菌基因组的提取利用PCR技术，对待鉴定细菌的16S rDNA序列进行扩增，其中正向引物27F：5’-A￣G￣A￣G￣T￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G-3’，反向引物1492R：5’- T￣A￣C￣G￣G￣C￣T￣A C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C G￣A￣C￣T￣T-3’。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，54 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循环33次，再在72 ℃延伸5 min后终止反应。 PCR产物通过1.0%琼脂糖胶电泳进行分析，缓冲液为TAE，委托福建省尚辰生物技术有限公司进行测序，将测序结果与NCBI上面进行BLAST同源性比对，选取同源性高的菌株模式菌株序列，用MEGA5.0的Neighbor—Joining构建系统发育树，Bootstrap值取1 000。

表1 6株细菌发酵液对松材线虫的杀线虫活性比较

2 结果和分析

2.1 具杀线虫活性内生细菌分离及筛选

经分离得105株马尾松内生细菌，筛选到6株能够比较有效的抑制松材线虫活性。由表1中可知，具有杀线虫活性的细菌发酵滤液处理松材线虫24 h后，死亡率在50%及以上，活性级别均不低于Ⅲ级，并且使线虫虫体渗漏或消解。6株细菌的杀线活性存在明显差异，细菌Z11-2培养滤液处理松材线虫24 h的致死率达到92%，与其他5株存在极显著差异，Z35-1和G36处理也超过85%；6株细菌对松材线虫的消解率也存在差异极显著，其中Z11-2培养滤液的消解水平最高，48 h后松材线虫虫体消解率为87.4%，其次为G36菌株，其消解率为77.5%，Z35-1培养滤液对松材线虫的消解率也超过了70%，说明这3株细菌培养液中含有较高的杀线虫活性物质，并可能含分解松材线虫体壁的物质。

2.2 具较高杀线虫活性内生细菌的鉴定

由表2可知，细菌Z11-2和G36菌体杆状，有芽孢形成，为革兰氏阳性。Z11-2形成乳白色稍有光泽的圆形半透明菌落，菌落表面光滑稍有凸起，边缘整齐；细菌G36菌落白色不透明，表面湿润光滑稍有凸起，边缘整齐。通过PCR技术，分别得到2株细菌16S rDNA的特异性扩增，将序列分别与GenBank中的序列进行比对，发现2株细菌与芽孢杆菌属的同源性都较高：菌株Z11-2与Bacilluspumilus的最大相似性达到100%，菌株G36与B.pumilus的同源性为99%。根据比对结果，选取芽孢杆菌属20种的模式菌株序列与细菌Z11-2和G36的16S rDNA序列构建系统发育树(见图1)，Z11-2和G36与B.pumilus(AY876289.1)位于同一簇群，亲缘关系最近，初步鉴定其为短小芽孢杆菌。

表2 2株具较高杀线活性细菌形态特征

图1 细菌Z11-2和G36的16S rDNA序列系统发育树

2 结论与讨论

在马尾松上分离得到6株对松材线虫活性具有抑制作用的细菌Z11-1，Z11-2，Z35-1，G31，G36，G42，其中细菌Z11-2和G36的杀线活性较强，其毒力级别在Ⅱ级以内，处理24 h的松材线虫死亡率分别为92%和89%，48 h线虫消解率分别为87.4%和77.5%。通过形态特征观察，结合16S rDNA序列分析，初步鉴定这2株细菌为短小芽孢杆菌(B.pumilus)。

具杀线活性的微生物及其代谢产物为数不少，但目前能够商品化的微生物制剂为数极少，植物寄生线虫生物防治细菌的研究是控制线虫危害的一种重要防治途径。据有关报道，至今已发现多种对松材线虫具有杀线虫活性的细菌，如徐华潮等[15]发现一些苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)的伴孢晶体蛋白对松材线虫有明显毒杀作用，Oliveira等[16]曾报道侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporu)对松材线虫具有杀线虫活性，郝颖[17]在腌制芥菜表面分离筛选得到1株具有杀松材线虫活性的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)LZ-01，朱丽梅、李亮亮等[9-11]从松树体内分离筛选出对松材线虫具有较高杀线虫活性的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensJK-JS3)和短小芽孢杆菌(B.pumilusLYMC-3)。筛选有效的拮抗细菌，对于开发新的植物寄生线虫生物防治细菌制剂有重要意义，但现在对内生细菌的研究报道，只是分离、纯化、种类鉴定、离体防治效果及室内防治效果测定，因林间防治效果受到多种复杂因素的影响，离体防治效果和室内防治效果的结果一般不能反映林间防治效果[18]。本试验将继续开展内生细菌用于线虫的林间防治试验，这对于保护森林资源，尤其是一些受松材线虫病威胁的风景名胜区、重点生态区的安全有重要意义。

本试验中发现细菌Z11-2和G36培养滤液不但使松材线虫死亡，还能造成线虫体壁被分解，引起线虫内容物的泄漏，最终使线虫虫体的消解，这与前人研究报道[9-10,19]基本相同。试验筛选出的细菌发酵滤液之所以对松材线虫有较高杀线活性，可能是产生了某种对松材线虫活性有抑制作用的物质，但该类物质的性质及其作用途径等尚不明确，不同菌株产生的物质是否相同也有待研究。

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