七氟烷预处理对老年大鼠心肌线粒体敏感性钾通道的影响

张斌　林宗航　何江

【摘要】 目的：研究七氟烷預处理对老年大鼠心脏功能和线粒体形态结构的影响及其机制。

方法：选取清洁级健康雄性SD大鼠60只，首先建立稳定的离体心脏灌注模型，经KH平衡液平衡15 min后随机将其分为假手术组、缺血再灌注（I/R）组、七氟烷预处理Ⅰ（Sevo Ⅰ）组（0.5 Mac七氟烷）、七氟烷预处理Ⅱ（Sevo Ⅱ）组（1.0 Mac七氟烷）、Sevo Ⅰ+5-HD组、Sevo Ⅱ+5-HD组，每组10只。比较平衡后，缺血前，再灌注5、15、30 min时的冠脉血流量（coronary flow，CF）、心率（heart rate，HR）、左室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）和左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。观察灌注末胞浆膜下线粒体（subsarcolemmal mitochondria，SSM）、心肌纤维间线粒体（intermyocardial fiber mitochondria，IFM）的形态学变化。结果：再灌注5、15、30 min，Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组CF、HR、LVDP均高于I/R组（P<0.01），LVEDP均低于I/R组（P<0.01）；Sevo Ⅰ+5-HD组CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ组（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅰ组（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD组CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ组（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅱ组（P<0.01）。电镜结果显示，Sevo Ⅰ组、Sevo Ⅱ组心肌线粒体形态保存较好，但联合应用K通道抑制剂5-HD后（Sevo Ⅰ+5-HD组、Sevo Ⅱ+5-HD组），其保护效应消失。结论：七氟烷预处理可增加老年大鼠缺血心脏的CF，减轻缺血再灌注对心肌细胞线粒体的损伤，而K通道抑制剂5-HD可以取消七氟烷预处理对老年大鼠缺血心肌的保护作用。

【关键词】 七氟烷预处理； 心肌缺血； 细胞线粒体

Effect of Sevoflurane Preconditioning on Myocardial Mitochondrial Sensitive Potassium Channel in Aged Rats with Ischemic/ZHANG Bin，LIN Zonghang，HE Jiang，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：028-031

【Abstract】 Objective：To study the effects of Sevoflurane preconditioning on cardiac function and mitochondrial morphology in aged rats with ischemia and its mechanism.Method：A total of 60 healthy male SD rats of clean grade were selected.First，establish a stable isolated heart perfusion model，after equilibrium of KH equilibrium liquid equilibrium 15 min，they were randomly divided into sham operation group，ischemia reperfusion group（I/R），sevoflurane preconditioningⅠ （Sevo Ⅰ） group（0.5 Mac Sevoflurane），Sevoflurane preconditioningⅡ（Sevo Ⅱ） group（1.0 Mac Sevoflurane），Sevo Ⅰ+5-HD group，Sevo Ⅱ+5-HD group，10 rats in each group.The coronary flow（CF），heart rate（HR），left ventricular developed pressure（LVDP） and left ventricular end diastolic pressure（LVEDP） after the balance，before ischemia，reperfusion 5，15 and 30 min

were compared.The morphological changes of subsarcolemmal mitochondria（SSM） and intermyocardial fiber mitochondria（IFM） at the end of perfusion were observed.Result：Reperfusion 5，15 and 30 min，the CF，HR and LVDP in Sevo Ⅰ group and Sevo Ⅱ group were higher than those of I/R group（P<0.01），LVEDP were lower than those of I/R group（P<0.01）.The CF，HR and LVDP in Sevo Ⅰ+5-HD group were all lower than those of Sevo Ⅰ group（P<0.01），and LVEDP were higher than those of Sevo Ⅰ group（P<0.01）.The CF，HR and LVDP in Sevo Ⅱ+5-HD group were all lower than that in Sevo Ⅱ group （P<0.01），and LVEDP were higher than those of Sevo Ⅱ group（P<0.01）.Electron microscopy showed that myocardial mitochondria were well preserved in Sevo Ⅰ group and Sevo Ⅱ group，but the protective effect disappeared after combined application of K channel inhibitor 5-HD（Sevo Ⅰ+5-HD group，Sevo Ⅱ+5-HD group）.Conclusion：Sevoflurane preconditioning can increase the CF of ischemic heart in aged rats，alleviate the injury of mitochondria after myocardial ischemia and reperfusion，and K-channel inhibitor 5-HD can cancel the protective effect of sevoflurane preconditioning on ischemic myocardium in aged rats.

【Key words】 Sevoflurane preconditioning； Ischemia myocardial； Myocardial mitochondria

First-authors address：Qingyuan Peoples Hospital，Qingyuan 511518，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.007

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌恢复血供后出现更为严重的心肌功能损伤，是临床麻醉工作中常见的病理生理过程，尤其心脏手术中多见[1]。大量的临床和实验研究均表明，给予七氟烷在心肌缺血或复灌注之初，可诱导产生与缺血预处理或缺血后处理类似的保护效果，从而减轻心肌缺血损害的程度[2-4]。本研究通过建立大鼠缺血再灌注模型，给予七氟烷预处理，观察其对缺血再灌注大鼠心脏功能及大鼠心肌线粒体结构的影响，旨在探讨七氟烷预处理对MIRI的保护作用及其可能机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及离体心脏灌注模型的建立 清洁级健康雄性SD大鼠60只，20～24月龄，体重320～370 g，由清远市人民医院实验动物中心提供。腹腔注射肝素对大鼠进行肝素化处理，30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠5 mL/kg用以麻醉大鼠。麻醉成功后，将大鼠置于实验台上并固定，寻找解剖标志剑突，沿胸骨下缘剪开胸腔，打开心包，暴露主动脉弓。沿心底部迅速横断主动脉，将心脏取出并迅速放于4 ℃的无钙台式液中，轻轻挤去心腔中的残余血液，游离主动脉根部。将离体心脏悬挂于灌注装置上，经主动脉泵入饱和台式液。整个灌注装置提前使用循环水浴箱进行预热，心脏的温度控制为（37±5）℃[5-10]。

1.2 实验动物分组 60只大鼠，制备离体心脏灌注模型，经KH平衡液平衡15 min后随机分成以下6组，每组10只。（1）假手术组：平衡后继续灌注KH液75 min；（2）缺血再灌注（I/R）组：平衡后灌注20 min，之后全心停灌25 min，再灌注30 min；（3）七氟烷预处理Ⅰ（Sevo Ⅰ）组：平衡期后使用0.5 Mac七氟烷饱和的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再改为KH液灌注30 min；（4）七氟烷预处理Ⅱ（Sevo Ⅱ）组：平衡期后使用1.0 Mac七氟烷饱和的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再改为KH液灌注30 min；（5）Sevo Ⅰ+5-HD组：平衡后使用0.5 Mac七氟烷饱和5-HD（100 μm）的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min；（6）Sevo Ⅱ+5-HD组：平衡后使用1.0 Mac七氟烷饱和5-HD（100 μm）的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min。

1.3 心功能指标测定 稳定后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将连接测压导管的球囊送入左心室，测压导管的另一端连接多导生理记录仪。分别在平衡后，缺血前，再灌注5、15、30 min时测定冠脉血流量（coronary flow，CF）、心率（heart rate，HR）、左室发展压（left ventricular developed pressure，LVDP）和左室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）。

1.4 心肌线粒体的形态学观察 再灌注末取心肌标本，采用差速离心法提取胞浆膜下线粒体（subsarcolemmal mitochondria，SSM）、心肌纤维间线粒体（intermyocardial fiber mitochondria，IFM），在高倍电子扫描显微镜下观察两种线粒体的形态学变化[11-13]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六组离体心脏缺血前后CF比较 平衡后和缺血前，六组离体心脏CF比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。再灌注5、15、30 min，除假手术组外其他五组CF均低于缺血前及平衡后（P<0.01）；Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组CF均高于I/R组（P<0.01）；Sevo Ⅱ組CF均高于Sevo Ⅰ组（P<0.01）；Sevo Ⅰ+5-HD组CF均低于Sevo Ⅰ组（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD组CF均低于Sevo Ⅱ组（P<0.01）。见表1。

2.2 六组离体心脏缺血前后HR、LVDP、LVEDP比较 平衡后和缺血前，六组离体心脏HR、LVDP、LVEDP比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。再灌注5、15、30 min，除假手术组外其他五组HR、LVDP均低于缺血前及平衡后（P<0.01），LVEDP均高于缺血前及平衡后（P<0.01）；Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组HR、LVDP均高于I/R组（P<0.01），LVEDP均低于I/R组（P<0.01）；Sevo Ⅱ组HR、LVDP均高于Sevo Ⅰ组（P<0.01），LVEDP均低于Sevo Ⅰ组（P<0.01）；Sevo Ⅰ+5-HD组HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ组（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅰ组（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD组HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ组（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅱ组（P<0.01）。见表2～4。

2.3 线粒体电镜结果 假手术组的正常线粒体：线粒体提取丰度较高，数目较多，线粒体形态完整，嵴清晰，少有肿胀，SSM和IFM无明显差别。Sevo Ⅰ组、Sevo Ⅱ组线粒体：IFM线粒体数目较多，形态完整，嵴清晰部分有空泡、肿胀，少数破坏；SSM线粒体数目较IFM少，大多形态完整，嵴较为清楚，部分有肿胀、空泡。I/R组、Sevo Ⅰ+5-HD组、Sevo Ⅱ+5-HD组线粒体：IFM线粒体数目明显减少，线粒体中度肿胀，部分嵴排列紊乱、不清楚，变性甚至破裂；SSM线粒体数目减少明显，残存线粒体多肿胀，基质丢失，视野充满线粒体碎片。

3 讨论

当今社会，急性心肌梗死仍是威胁人类生命的首要病因。心肌I/R损伤仍是不能实现急性心肌梗死患者心肌有效再灌注的主要原因。因此如何能够既尽早恢复缺血组织血流，又不发生再灌注损伤，是缺血性疾病防治中亟待解决的重要课题[11-14]。大量研究表明，线粒体内膜上存在敏感性钾通道对生物膜的稳定性、线粒体及心肌细胞的功能起着非常重要的作用。同时，吸入性麻醉药物如七氟醚、安氟醚、异氟醚等可以通过影响活性氧、线粒体钾通道的开放及炎症因子的释放及对细胞凋亡的影响，可减少心肌组织细胞的缺血再灌注损伤[14-17]。

本研究结果显示，再灌注5、15、30 min，Sevo Ⅰ

组与Sevo Ⅱ组CF、HR、LVDP均高于I/R组（P<0.01），LVEDP均低于I/R组（P<0.01）。电镜结果显示，SevoⅠ组、SevoⅡ组预处理有效地保护了再灌注大鼠心肌细胞线粒体结构的完整，有利于再灌注期间心肌细胞和线粒体功能的恢复，提示七氟烷预处理能够对缺血再灌注心肌起到保护作用。本研究在Sevo Ⅰ组、Sevo Ⅱ组预处理时选择用线粒体敏感性钾通道阻滞剂5-HD（100 μm）共同灌注15 min后洗脱。结果显示，再灌注5、15、

30 min，Sevo Ⅰ+5-HD组CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ组（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅰ组（P<0.01）；Sevo Ⅱ+5-HD组CF、HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ组（P<0.01），LVEDP均高于Sevo Ⅱ组（P<0.01）。电镜结果显示，联合应用K通道抑制剂5-HD后（Sevo Ⅰ+5-HD组、Sevo Ⅱ+5-HD组），其保护效应消失，表明K通道抑制剂5-HD可以取消七氟烷预处理对老年大鼠缺血心肌的保护作用，提示七氟烷预处理产生心肌保护作用很可能是通过开放线粒体钾通道实现的[18-20]。

综上所述，七氟烷预处理可以对老年大鼠缺血再灌注心脏收缩功能受损和线粒体结构完整性起到一定程度的逆转和保护作用，这一发现为临床使用吸入性麻醉药七氟烷预防MIRI提供了理论依据。

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（收稿日期：2017-10-16） （本文编辑：董悦）