甘露消毒丹及其挥发油对流感病毒感染小鼠肺部炎症相关因子的影响

刘光华　贾晓　儒敏娜

【摘要】 目的：觀察甘露消毒丹（Ganlu Xiaodu Mircropill，GXM）及其挥发油对流感病毒（influenza virus，IV）感染小鼠肺组织病理炎症、血清IL-6、TNF-α含量及肺组织NS1、NF-κB表达的影响，探讨其抗IV感染的机制。方法：SPF级BALB/c小鼠108只，随机分为正常组（A组）、模型组（B组）、GXM灌胃组（C组）、GXM滴鼻组（D组）、GXM合用组（E组）、奥司他韦组（F组），除A组外，其余5组以IV FM1-6-E2滴鼻造模。于造模后第3、7、10天进行取材，对小鼠肺组织病理炎症程度进行评分，并计算肺指数及干湿比，在电镜下观察肺组织超微结构，采用ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α的含量，采用qPCR方法检测肺组织中NS1的基因表达，采用Western Blot法检测肺组织NF-κB的表达。结果：IV感染后，小鼠肺组织出现炎症改变，其肺组织病理评分、肺指数均升高，干湿比降低，第7天炎症最为严重。电镜下可见肺泡上皮细胞肿胀，纤毛减少、脱落，细胞器减少。血清IL-6、TNF-α含量均升高，肺组织NF-κB表达升高，于第3天达峰值，而后降低；NS1表达亦升高，之后逐步下降。与B组比较，各治疗组均能够减轻肺部炎症，降低病理评分、肺指数，升高干湿比，降低TNF-α含量，下调NF-κB表达，其中尤以E、F组作用最为明显（P<0.05）。治疗第3天，与B组比较，D、E、F组均能下调NS1的表达（P<0.05），而C组与B组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；C、E、F组均能够降低IL-6含量（P<0.05），而D组与B组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。治疗第7天，C组能够下调NS1表达，D组能够降低IL-6含量（P<0.05）。结论：GXM可降低IV感染后肺部炎症，降低NS1蛋白的表达；减少促炎因子的释放，其滴鼻灌胃合用较单一给药有优势。

【关键词】 流感病毒； 甘露消毒丹； 挥发油； 细胞因子

Effects of Ganlu Xiaodu Micropill and Its Volatile Oil on Lung Inflammation Related Factors in Mice Infected with Influenza Virus/LIU Guanghua，JIA Xiaoru，MIN Na，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：001-006

【Abstract】 Objective：To observe the effects of Ganlu Xiaodu Micropill（GXM） and its volatile oil on pathological inflammation，IL-6 and TNF-α in serum，and the expression of NS1 and NF-κB in lung tissue of mice infected with influenza virus（IV），to explore the mechanism of anti IV infection.Method：108 SPF BALB/c mice were randomly divided into normal group （group A），model group（group B），GXM lavage group（group C），GXM nasal drops group（group D），GXM group（group E），Oseltamivir group（group F）；except group A，the other

5 groups were made models with IV FM1-6-E2 nasal.On the third，seventh，tenth day after modeling，pathological inflammation were scored，lung index and the ratio of dry and wet in mice lung tissue were assessed，and ultra structure of lung tissue was observed under electron microscope，ELISA method was used to detect the content of IL-6 and TNF-α in serum，the expression of NS1 gene in lung tissue was detected by qPCR method， and NF-κB by Western Blot method.Result：After IV infection，inflammation changes in the lung tissue of mice，the lung pathological score and lung index increased；the ratio of dry and wet decreased，on seventh day，inflammation was the most serious.Under electron microscope，alveolar epithelial cells of mice lung tissue swelled，the cilia decreased and shedding，organelles decreased.The content of IL-6 and TNF-α in serum and the expression of NF-κB in lung tissue increased，and all reached peak on the third day，then decreased，the expression of NS1 increased in the same time.Compared with group B，the treatment groups can reduce lung inflammation，reduce the pathological score and lung index，rise the ratio of dry and wet，reduce the content of TNF-α，cut the expression of NF-κB，especially in group E and F were the most obvious（P<0.05）.On the third day of treatment，the expression of NS1 was down regulated in group D，E and F（P<0.05），while the effect of group C was not obvious（P>0.05）.Group C， E and F could reduce the content of IL-6（P<0.05），while the effect of group D was not obvious（P>0.05）.On the seventh day of treatment，group C could reduce the expression of NS1，and group D could reduce the content of IL-6（P<0.05）.Conclusion：GXM can reduce lung inflammation and the expression of NS1 protein after IV infection，and reduce the release of proinflammatory factors，the combination of nasal drops and lavage administration has advantage over single administration.

【Key words】 Influenza virus； Ganlu Xiaodu Micropill； Volatile oil； Cytokine

First-authors address：Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.001

流行性感冒（流感）是一种常见的急性呼吸道传染病，由流感病毒（influenza virus，IV）感染引起，其发病率高，传染性强，人群普遍易感[1]。临床表现轻重不一，轻者仅表现为感冒，病程短、症状轻、预后良好，重者可发展为流感病毒性肺炎，甚则危及生命[2]。中医药在防治IV感染方面具有重要的作用，临床多以辛凉解表或清热解毒之品治之每获较好疗效。但近年由于雾霾等环境污染及人们生活方式的改变、饮食的偏嗜，体虚湿盛或湿热内蕴者日益增多，IV等病原微生物极易附着于PM2.5等微尘颗粒侵袭人体，并因人的体质而从化，发为湿热性质的病证。临床已有报道用甘露消毒丹（Ganlu Xiaodu Micropill，GXM）治疗IV感染取得了较好的疗效[3]。本研究从湿热蕴毒立论，探讨清热解毒、利湿化浊的GXM滴鼻、灌胃两种不同给药途径对IV感染小鼠肺部炎症的影响。通过观察小鼠肺组织病理炎症、肺指数、干湿比、肺组织超微结构、血清中IL-6、TNF-α含量变化及肺组织中NS1、NF-κB表达，揭示GXM一方两用对IV感染的效用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47（H1N1），由辽宁中医药大学附属医院病毒室保存。

1.1.2 实验动物 SPF级BALB/c小鼠108只，体重（20±2）g，雌雄各半，购买于辽宁长生生物技术有限公司，生产合格证号：SCXK（辽）2013-009，使用合格证号：SYXK（辽）2015-0001。

1.1.3 药物及制备 GXM药物组成：滑石、黄芩、茵陈、石菖蒲、川贝母、木通、藿香、连翘、白蔻仁、薄荷、射干，中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局，经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定为正品。饮片以8倍量70%乙醇加热回流提取3次，1 h/次，合并每组3次提取的药液，回收溶剂并浓缩，制成含生药1 g/mL混悬液。挥发油制备：将中药粉碎，加8倍量水浸泡，装入冷凝器中，水蒸气蒸馏提取6 h，分层分取挥發油，制成含生药6 g/mL的药液。磷酸奥司他韦颗粒（生产厂家：宜昌长江药业，批准文号：国药准字H2009372）75 mg，配成1 mg/mL的溶液。每组药液均4 ℃保存备用。

1.1.4 试剂与仪器 Trizol总RNA提取试剂，Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒、DEPC、DNAmarker DL2000，购于大连宝生物公司；小鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒，Phospho-NF-κB p65抗体试剂盒，GAPDH，ECMII of Western-blot检测试剂盒浓缩型免IgG二抗，购于武汉博士德公司。

1.1.5 主要仪器 TP1020型自动组织脱水处理机；EG1150型石蜡包埋机（LEICA，德国）；RM2135型病理精密轮转切片机（LEICA，德国）；BX50F4型显微镜（OLY-MPUS）；荧光定量PCR仪（LC-Ⅱ）；IM71型酶标仪；PowerPac Universal电泳通用型电源；Trans-Blot SD半干转印系统（Bio-Rad，美国）；FlourChem Q蛋白印记成像系统（Proteinsimple，美国）；低温高速离心机（Heraeus，德国）；H-7650型透射电镜（日本株式会社）等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 用随机数字表法将小鼠分为6组，分别为正常组（A组）、模型组（B组）、GXM灌胃组（C组）、GXM滴鼻组（D组）、GXM合用组（E组）、奥司他韦组（F组），每组18只，对各组小鼠进行标记称重。

1.2.2 模型制备 实验动物适应性饲养1 d后，除A组动物外，其余动物在乙醚轻度麻醉下，经鼻腔接种甲型流感病毒FM1株（0.1 mL/只）。A组动物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔接种生理盐水0.1 mL。

1.2.3 给药方法 C组、E组、F组于感染后24 h开始灌胃给药，0.3 mL/（d·次），连续10 d；D组、E组于感染后24 h开始滴鼻给药，0.04 mL/（d·次），连续10 d。A组、B组同步灌胃生理盐水0.3 mL。最后一次给药后禁水、禁食4 h。

1.2.4 标本采集 于造模后第3、7、10天采集标本，每组取6只，称重后摘眼球取血，储存于促凝管中，以4 000 r/min的速度离心5 min，取上层血清存于EP管中，-80 ℃冰箱冷藏以备ELISA检测。对小鼠进行颈椎脱臼处死，在无菌操作台将小鼠仰卧位固定，酒精消毒颈部及胸腹部，以无菌专用器械进行操作，打开胸腔，取出整个肺脏，称取肺重，计算肺指数（肺质量/体质量×100%）。取左肺放入4%多聚甲醛中固定，常规脱水、石蜡包埋、行HE染色，取右肺组织-80 ℃冻存，以备Western Blot、qPCR检测。根据文献[4]进行肺组织病理学评分。左肺下叶单独称重，置于37 ℃恒温箱中48 h后，再次称重，计算干湿比（干重/湿重）。第7天处死小鼠后迅速取其右肺上叶组织，2.5%戊二醛预固定，1%锇酸固定，环氧树脂浸透、包埋，切片，乙酸双氧铀、枸橼酸铅双层染色，置于透射电镜下观察肺组织超微结构的变化。

1.2.5 qPCR法NS1基因含量测定 引物根据文献[5]设计，NS1上游引物：5-ATGGATCCAAACACTGTGTC-3；下游引物：5-TCAAACTTCTGACCTAATTGTTCC-3；GAPDH，G1：5-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3，G2：5CTCAGTGTAGCCCAGGATGC 3，由北京六合华大基因合成。取肺组织制造细胞悬液，用Trizol提取细胞总RNA。分析RNA的纯度及完整性，检测RNA质量合格后，进行反转录，以反转录产物为模板，加入NS1的引物，进行qPCR检测。

1.2.6 血清IL-6、TNF-α表达水平检测 采用双抗体夹心ELISA法，测定小鼠血清中IL-6、TNF-α含量，分别用小鼠IL-6、TNF-α的ELISA试剂盒。检测程序按照试剂盒说明书进行。

1.2.7 Western Blot法检测NF-κB蛋白的表达 用总蛋白提取试剂提取总蛋白，离心取上清液。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，提取液中加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃变性10 min，蛋白上样每孔10 μL，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜30 min，2%BSA室温封闭2 h。一抗室温孵育2 h，4 ℃过夜，TBST 10 min/次洗膜（3次），二抗室温孵育1 h，TBST 10 min/次洗膜（3次）。ECL发光，Fluor Chem Q蛋白质印迹成像系统显色。

1.3 统计学处理 所有实验计量数据均以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 20.0统计软件分析，统计方法采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺指数、干湿比及病理评分比较 A组第3、7、10天的肺指数均低于B组，干湿比均高于B组，差异均有统计学意义（P<0.05）。IV感染后，B、C、D、E、F组小鼠肺組织炎症病理评分、肺指数均于第7天达峰值。治疗第3天，C、D组与B组的病理评分、肺指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05），C组与E组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；治疗第7、10天，各治疗组与B组的病理评分、肺指数比较，差异均有统计学意义（P<0.05），C、D组与E组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。IV感染后，各时间点小鼠肺组织干湿比均于第3天达谷值。治疗第3天，C、D组与B组的干湿比比较，差异均无统计学意义（P>0.05），且C、D组与E组的干湿比比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；治疗第7天，除D组外，其余各治疗组的干湿比与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），且C、D组与E组的干湿比比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；治疗第10天，各治疗组干湿比与B组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），且C、D组与E组的干湿比比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 小鼠肺组织超微结构改变 正常小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞结构完整，细胞膜表面微绒毛丰富，血管内皮细胞及基膜完整（图1A）。IV感染小鼠肺泡上皮细胞肿胀，纤毛减少，脱落（图1B）；细胞表面破坏，胶原纤维化，纤毛脱落，稀疏（图1C）；血管明显肿胀，核染色质凝集粗块状，聚集于细胞核周围，Ⅱ型细胞板层小体增多（图1D）。

2.3 各组小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比较 IV感染后，B、C、D、E、F组小鼠血清中IL-6含量于治疗第3天达峰值，然后逐渐降低。治疗第3天，C、E、F组的IL-6含量均低于B组，差异均有统计学意义（P<0.05），而D组与B组比较，差异无统计学意义（P>0.05），C、D组与E组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；治疗第7天，各治疗组的IL-6均低于治疗第3天，差异均有统计学意义（P<0.05），但C组与E组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗第10天，各治疗组的IL-6均低于治疗第7天，且C、D组与E组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。治疗第3天，各治疗组血清中TNF-α含量均出现峰值，而后降低。治疗第3、7天，各治疗组TNF-α含量较B组均有所下降，其中E组效果最为明显，且C、D组与E组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；治疗第10天，各组均显著低于B组，其中D组与E组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），C组与E组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 各组小鼠肺组织NS1基因表达结果比较 治疗第3天，D、E、F组的NS1基因表达较B组均有所下降，差异均有统计学意义（P<0.05），而C组与B组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗第7、10天，各治疗组的NS1基因表达较B组均有所下降，差异均有统计学意义（P<0.05），且C、D组与E组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表4。

2.5 各组小鼠肺组织NF-κB表达结果的比较 IV感染后，B组较A组肺组织中NF-κB表达明显增多，于治疗第3天达峰值。治疗第3、7、10天，各治疗组的NF-κB均低于B组，且C、D组均高于E组多，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图2、表5。

3 讨论

IV变异快，动物源性的IV在人群中的高致死率和广泛流行性，已经引起了全世界的高度关注[6]。当前国内雾霾天气频繁出现，儿童、老年人等弱势群体IV感染率明显升高。有研究发现雾霾期间儿童患呼吸系统疾病的风险提高26.95%[7]。IV属正粘病毒科，为单分子负链RNA病毒，由包膜和致密的病毒核心组成。NS1是IV最重要的一个非结构蛋白，在IV感染宿主细胞中，NS1蛋白高水平表达，是引起宿主受损的重要因素之一[8]；NF-κB为核转录因子，能够与因启动子部位的κB位点特异性结合，激活状态下进入细胞核并调控DNA的转录过程，参与机体免疫应答、炎症反应等[9]。IV感染机体后，机体启动免疫应答机制，NS1蛋白表达升高，同时激活了NF-κB信号通路，活化的NF-κB调控炎症因子IL-6、TNF-α等表达转录，引起宿主细胞的炎性损伤甚至凋亡[10]。促炎因子IL-6是炎症反应中的重要细胞因子，参与肺部炎症病理过程[11]；TNF-α是重要的炎症促进因子，在体内主要产生单核巨噬细胞，对肺脏具有强烈的毒性，它能诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏等，从而诱发并进一步加重炎症反应[12]。本实验结果显示，IV感染后小鼠肺指数升高，干湿比降低，电镜下可见小鼠肺组织的细胞结构破坏，核膜与质膜模糊不清，细胞器减少，细胞浆内出现较多的空泡样病变，肺内炎症明显。肺组织NS1蛋白表达增多，早期明显；NF-κB蛋白表达增加，于治疗第3天达到峰值；血清中IL-6、TNF-α含量均升高，于第3天达到峰值，然后逐渐降低。在IV感染小鼠初期，细胞因子IL-6和TNF-α含量及肺组织中NF-κB、NS1表达均呈上升趋势，这可能与感染后的免疫应激有关。

中医学认为，IV肺炎系气候反常，感受邪毒、疠气导致肺气郁痹、痰瘀阻滞而发病，雾霾天气，湿浊弥漫，易与时疫邪毒胶结致病，湿热交蒸，郁阻气分，蕴毒上壅，具有“湿毒”“肺痹”特征[13]。“所受之邪，每从其人之脏气而化”，故IV极易附着于雾霾微尘颗粒侵袭人体，感染后可从化于人体的湿热体质而呈湿热证的特点。临床治疗选用GXM，该方为“治湿温时疫之主方”，芳香辟秽以醒窍，清热祛湿以化痰，解毒化浊以开痹。方中芳香辛散的药味含有多种挥发油成分，可以滴鼻给药。不同的成分、不同的提取方法、不同的给药途径，同种处方亦会产生不同的疗效点。本次研究发现GXM能够减轻肺组织超微结构病变程度，正向调节炎症因子，减缓IV感染小鼠急性期的炎性反应，降低肺组织中NS1、NF-κB蛋白的表达。经GXM治疗后，各时间点小鼠肺指数、肺组织炎症病理评分均降低、干湿比均升高，逐渐接近于正常，其中GXM合用组起效时间最早，其次为GXM灌胃组、滴鼻组。GXM能够降低TNF-α、IL-6含量和抑制NF-κB表达水平，GXM合用组效果最好，第3天即起效，GXM灌胃组第7天亦发挥疗效，而GXM滴鼻组疗效较弱。GXM能够降低NS1蛋白表达水平，GXM合用组效果最好，起效时间最早（第

3天）；GXM滴鼻組在第3天能够降低NS1表达，而GXM灌胃组则于第7天发挥疗效。GXM滴鼻组起效迅速且疗效明显，提示这可能与GXM含有的挥发油经鼻吸收后快速地诱导黏膜免疫反应，且直接灭杀IV有关。现代药理研究提示，藿香、石菖蒲、茵陈、薄荷等都含有挥发性物质[14-18]。

综上所述，GXM具有抗IV感染的作用，能够有效控制IV感染小鼠肺部炎症，这可能与抑制相关炎症因子、降低NS1蛋白的表达有关。GXM挥发油滴鼻在早期抗病毒作用中效果明显，抗感染过程中挥发油和醇提物合用，较单一给药效果更加明显，且有一定的时效性，其深入作用机制有待于进一步研究。

参考文献

[1]中华医学会呼吸病学分会.流行性感冒临床诊断和治疗指南（2004年修订稿）[J].中华结核和呼吸杂志，2005，28（1）：5.

[2]郝欧美，王雪峰，刘双，等.敷胸膏对流感病毒肺炎大鼠肺组织JNK，MKK4表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（23）：111-115.

[3]毕岩，岳冬辉，高玉伟，等.甘露消毒丹对H1N1流感病毒感染小鼠细胞因子的影响[J].中华中医药杂志，2014，29（12）：3950-3953.

[4]刘晓红，辛德莉，侯安存，等.小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立及组织病理学评分方法的应用[J].重庆医学，2004，33（9）：1338-1340.

[5]刘永飞，李志辉，王慧煜，等.A型流感病毒NS1蛋白对细胞生长调控的影响[J].中国兽医科学，2012，42（12）：1242-1248.

[6]于玉凤，郭晓兰，王颖，等.H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析[J].中山大学学报（医学科学版），2013，34（5）：657-665.

[7]崔亮亮，李新伟，耿兴义，等.2013年济南市大气PM2.5污染及雾霾事件对儿童门诊量影响的时间序列分析[J].环境与健康杂志，2015，32（6）：489-493.

[8]郭莹莹，王靖飞.A型流感病毒NS1蛋白结构研究进展[J].生命科学，2010，22（2）：115-118.

[9] Shishodia S，Koul D，Aggarwal B B.Cyclooxygenase（COX）-2

in inhibitor celecoxib abrogates TNF-induced NF-kappa B activation through inhibition of activation of I kappa B alpha kinase and Akt in human non-small cell lung carcinoma：correlation with supp ression of COX-2 synthesis[J].Immunol，2004，173（3）：2011-2022.

[10]王晓晨，吉爱国.NF-κB信号通路与炎症反应[J].生理科学进展，2014，45（1）：68-71.

[11]王成祥，高桂新，魏守超，等.益气清瘟解毒合剂对流感病毒FM1感染小鼠肺中IFN-γ，TNF-α，IL-10及IL-6蛋白动态表达的影响[J].中国中药杂志，2005，30（7）：541-544.

[12]倪新强，韩新民.泻肺平喘灵及其拆方对“肺合大肠”模型大鼠血清内毒素及肿瘤坏死因子-α的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（14）：136-139.

[13]刘光华，吴振起.从“肺痹”论治儿童肺炎的临床经验[J].中国中西医结合儿科学，2014，6（1）：37-38.

[14]李海峰，石若娜，韩文静，等.石菖蒲药理作用及其机制的研究进展[J].时珍国医国药，2016，27（11）：2728-2730.

[15]曹锦花.茵陈的化学成分和药理作用研究进展[J].沈阳药科大学学报，2013，30（6）：489-494.

[16]李子行.浅谈广藿香药理作用研究进展[J].今日健康，2015（1）：268.

[17]房海灵，李维林，任冰如，等.薄荷属植物的化学成分及药理学研究进展[J].中国药业，2010，19（10）：13-17.

[18]韩云，邹俊驹，曹蓉，等.甘露消毒丹及其拆方对CoxA16感染小鼠炎症因子及NF-κB信号通路的影响[J].中医药导报，2017，24（6）：15-18.

（收稿日期：2018-01-08） （本文编辑：张爽）