清热利湿方及虎杖苷对SD大鼠肛旁创面肉芽组织血管通透性及Src、VE-cadherin细胞因子表达的动态影响

杨豪杰，王振宜，刘 华

（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肛肠科，上海 200437）

肛肠术后创面多表现为皮肤潮湿、创面渗液、脓液黏稠较多、肉芽组织淡红，全国名老中医柏连松教授归之于“湿热下注”之症[1-2]。现代医学认为创面红肿热痛（局部湿热）程度与毛细血管渗出、局部炎症反应、细菌感染密切相关，而血管通透性增加是其关键病理改变。最新研究表明Src/VE-cadherin信号通路在调节血管通透性，控制炎症反应等方面起着重要作用[3-4]。本研究以SD大鼠肛旁创面模型为研究对象，进一步研究清热利湿方及虎杖苷通过调控血管通透性促进创面愈合的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 采用清洁级SD大鼠108只，雄性，体质量（300±50）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号：SCXK（沪）2012-0002。于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物房适应性饲养1个月。

1.2 药物与试剂 清热利湿方采用柏连松教授经验方，由虎杖20g，蒲公英20g，苦参10g，黄柏10 g组成，由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院制剂室按比例制备成熏洗液备用（实际外洗比例为水煎剂:水=1:9）。生理盐水（上海国药集团化学试剂有限公司产品），虎杖苷（上海同田生物技术有限公司产品），伊文氏蓝晶体（美国Sigma lifes cience公司产品）。伊文氏蓝溶液的配制方法：称取伊文氏蓝晶体1g，加入100mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，溶解后加1mL1%Na2CO3溶液过滤；4℃保存。临用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀释成0.01%浓度使用。Src、VE-cadherin Elisa试剂检测盒（上海源叶生物科技有限公司产品，批号E20160901A）。

1.3 仪器 酶标仪（epoch，Bio-Tek公司产品）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及干预 将大鼠随机分为清热利湿组、虎杖苷组、生理盐水组，每组36只。参照岑瑛的方法[5]于术前3 d用8% Na2S脱毛，造模时用10%水合氯醛麻醉（每100 g 大鼠体质量0.4 mL）。使用自制手术器械在大鼠臀部做直径1.8 cm，面积为2.54 cm2的圆形切口创面，全层切除皮肤及筋膜直至肌肉表层。止血后放入清洁代谢钢丝笼内饲养，不予包扎任其自然感染，形成肛旁创面模型。术后24 h起，各组分别用药物或生理盐水浸浴治疗，2次/d，20 min/次。药液以没大鼠创面上3 cm为度，铁丝笼置40 ℃电热恒温水浴箱，待药液达40 ℃时开始外洗。

2.2 取材 每组大鼠中随机选取36只，分别于术后第3、7、11 天每组各选12只取局部创面肉芽组织待用；其中4只行尾静脉注射伊文氏蓝溶液（30 μg/g，PBS 100 μL /只），30 min后取局部创面肉芽组织待用。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 肉眼观察 肉眼观测术后第3、7、11 d各组创面愈合情况。

2.3.2 血管通透性 将经伊文氏蓝染色后的肉芽组织分别精密称取（105±5）mg，溶于有机溶剂Formamide（2 mL）中，室温下静置48 h，使用移液器吸取200 μL上清液，置于全自动酶标分析仪中（检测波长420 nm）测量OD值。

2.3.3 Src、VE-cadherin含量测定 测定方法参考Src、VE-cadherin Elisa试剂盒说明书。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计。计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料用率（%）表示，多组计量资料如服从正态分布且方差齐，组间比较采用单因素方差分析，组内比较用配对t检验，方差不齐，先校正方差，然后进行方差分析；重复测量数据采用重复测量的方差分析；不服从正态分布者，采用非参数检验；组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α = 0.05。

3 实验结果

3.1 肉眼观察 术后第3天生理盐水组大鼠创面有较多渗液，创面红肿，水肿较为明显；虎杖苷组大鼠创面有少量渗液，明显少于生理盐水组，部分创面伴有红肿；清热利湿组的渗液基本消失并开始结痂愈合，未见明显红肿，创面水肿不明显。术后第7天生理盐水组大鼠创面仍有少量渗液，且渗液明显多于其余两组，创面红肿较明显，但较术后第3天已有明显改善；虎杖苷组大鼠创面渗液基本消失，创面仍伴有可见红肿；清热利湿组的愈合情况较好，创面渗液消失，已基本接近愈合，未见明显水肿和渗出。术后第11天生理盐水组大鼠创面有少量渗液，创面较其余2组红肿略明显；虎杖苷组仍有少量渗液，多于清热利湿组，创面水肿不明显；清热利湿组的愈合情况较好，创面渗液消失，未见明显水肿和渗出。

3.2 血管通透性 经单因素方差分析，术后第3天 3组伊文氏蓝渗出比较差异有统计学意义（P＜0.05）；术后第7，11天3组伊文氏蓝渗出比较差异无统计学意义（P＞0.05），故对术后第3天进一步比较。经LSD-t检验，结果提示术后第3 天清热利湿组与虎杖苷组伊文氏蓝渗出情况比较差异无统计学意义（P＞0.05），但二者渗出均少于生理盐水组（P＜0.05）。见表1。

表1 术后第3、7、11 天各组伊文氏蓝OD值比较（±s ，n =4）

表1 术后第3、7、11 天各组伊文氏蓝OD值比较（±s ，n =4）

注：与生理盐水组比较，# P＜0.05

组 别 第3天 第7天 第11天清热利湿组 3.65±0.17# 1.28±0.27 1.23±0.19虎杖苷组 3.72±0.12# 1.26±0.32 1.25±0.14生理盐水组 4.07±0.21 1.69±0.65 1.27±0.21

3.3 Src、VE-cadherin含量 Elisa法检测各组创面肉芽组织中Src、VE-cadherin含量。Elisa结果显示术后第3、7、11天各组肉芽组织中Src浓度均存在明显差异，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后第3、7天，生理盐水组Src浓度大于其他2组（P＜0.05），清热利湿组与虎杖苷组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。术后第11天，生理盐水组的Src浓度大于其他2组的Src浓度（P＜0.05），虎杖苷组Src浓度大于清热利湿组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组肉芽组织Src浓度变化（±s ，n = 4） pg/mL

表2 各组肉芽组织Src浓度变化（±s ，n = 4） pg/mL

注：与生理盐水组比较，# P＜0.05，与虎杖苷组比较，△P＜0.05

组 别 第3天 第7天 第11天生理盐水组 4.66±0.08 4.45±0.20 3.89±0.27清热利湿组 3.81±0.31# 3.23±0.56# 2.84±0.23#△虎杖苷组 4.07±0.20# 3.58±0.04# 3.35±0.17#

Elisa结果显示术后第3、7天各组肉芽组织中VE-cadherin浓度比较差异无统计学意义（P＞0.05）。术后第11天，生理盐水组的VE-cadherin浓度低于其他2组（P＜0.05），虎杖苷组VE-cadherin浓度低于清热利湿组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组肉芽组织VE-cadherin浓度变化（，n = 4pg/mL

表3 各组肉芽组织VE-cadherin浓度变化（，n = 4pg/mL

注：与生理盐水组比较，# P＜0.05，与虎杖苷组比较，△P＜0.05

组 别 第3天 第7天 第11天生理盐水组 4.09±0.20 4.27±0.16 4.60±0.09清热利湿组 4.22±0.05 4.78±0.38 7.23±1.10#△虎杖苷组 4.08±0.20 4.38±0.26 5.67±0.28#

其中Src标准拟合曲线：Y=0.264X+0.118，R2=0.962；VE-cadherin标准拟合曲线：Y=0.32X+0.21，R2=0.971。通过450 nm波长测量所得的OD值在标准曲线上得出相应浓度后，乘以稀释倍数（5倍），即为实际样品浓度。

3 讨论

创面炎症渗出等湿热证象的现代病理学关键是血管通透性增加。通透性过度在临床上表现渗出增多，不利于创面愈合。血管内皮钙黏附素（VE-cadherin）是血管内皮细胞黏附连接的主要成分，受Src调控。当Src分泌增多或活性增强，将使VE-cadherin 磷酸化后重新分布，使得内皮细胞间的紧密连接松脱，毛细血管内皮细胞之间缝隙加大，血管通透性提高。反之内皮细胞连接紧密，通透性降低[6-7]。因此，Src/VE-cadherin 信号通路在血管通透性中的作用受到高度重视。课题组前期在总结柏连松教授清热利湿方外洗方基础上，开展了一系列临床与实验研究，证实清热利湿方外洗能有效改善患者伤口湿热渗出症状，促进愈合[8-11]。进一步研究清热利湿方及其有效成分通过调控血管通透性促进创面愈合的作用机制具有重要意义。

本研究通过肉眼观察发现与生理盐水相比，清热利湿方与虎杖苷均能更有效控制创面炎性渗出，促进创面愈合。伊文氏蓝染色法结果与肉眼观察结果一致，清热利湿方与虎杖苷均能降低血管通透性，进而控制局部炎症，促进创面愈合。这一发现提示清热利湿方及虎杖苷可能通过调控Src/VE-cadherin信号通路，降低局部创面通透性，促进创面愈合。因此课题组以Elisa法检测其对创面肉芽组织Src、VE-cadherin细胞因子表达的动态影响，旨在初步验证这一假说。结果表明清热利湿方与虎杖苷均能抑制创面组织Src表达，清热利湿方效果更佳。此外，结果还表明清热利湿方与虎杖苷并不能非常有效提高创面组织VE-cadherin表达。Src/VE-cadherin信号通路是具有多生物学效性的细胞信号转导途径[12-15]，受血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血管生成素I（AngI）等多种细胞因子的调控[16-18]。本研究初步发现清热利湿方与虎杖苷主要通过抑制Src表达，调控Src/VE-cadherin信号通路，但其确切的作用机制仍悬而未决。此外，中医复方是一个高度复杂的化学物体体系，清热利湿方中的中药活性成分可通过作用于多个靶点，影响多条信号转导通路。除了虎杖苷，其他有效成分的作用机制及相互影响仍有待进一步研究。

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