不同N-甲基-N-亚硝基脲处理下高粱离体花粉的活力解析

岑慧慧 ，田承华 ，程庆军 ，屈雅娟 ，牛鹏飞 ，李 楠，岳忠孝 ，李 菁 ，崔桂梅 ，田怀东 ，4

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院高粱研究所，山西晋中030600；3.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；4.山西景康农业技术推广有限公司，山西寿阳045400）

高粱作为主要粮食作物之一，在农业、食品、饲料、能源、酿造、医药等诸多领域被广泛利用，是支撑经济社会发展的重要资源。然而，随着在高粱品种培育、推广及其生产活动中，人们对育种材料、品种与栽培环境的选择性制约，高粱在育种研究中面临着多样性弱化和生存环境恶化的局面。因此，开发有效的诱变育种技术，解决当前高粱面临的问题是作物育种的任务之一。

人工诱变是作物种质创新的有效途径，主要包括物理诱变、生物诱变与化学诱变[1-2]。其中，化学诱变是用烷化剂等化学诱变剂处理作物的器官、组织、细胞，诱发突变体的方法，其具有操作简单、低成本、高基因诱变率等优点。国内外主要使用EMS处理种子等器官进行高粱诱变，已获得了一些植株和籽粒性状的突变体[3-7]。然而，由于EMS是一种有机溶剂，对种子的渗透性较差，并且处理种子容易产生嵌合体，诱变效率较低。截至目前，高粱突变体的利用研究促进了少数高粱基因的分子鉴定与功能解析[8-15]，然而，绝大多数高粱基因的生物学功能仍然是未知的。为了满足后基因组时代高粱基因组学与育种研究对大量基因突变材料的需求，有必要开发高效的高粱基因化学诱变技术。

MNU是一种水溶性的高效基因化学诱变剂，在一些哺乳动物与微生物诱变研究中已被证明可以通过作用于核酸底物，使得碱基甲基化，进而引起GC转变成AT[16-17]。

本研究采用TTC染色法，研究了不同MNU诱变因素对高粱离体花粉活力的影响，旨在为高粱基因高效诱变技术的开发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料和试剂

供试高粱自交系M02-16种植于山西省高粱研究所试验基地，在高粱开花期，每天8：00—9：00，收集适量花粉于硫酸纸袋，迅速带回实验室过筛，将过筛后的花粉放在培养皿中置于冰箱，干燥状态下4℃保存。MNU由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验 参照李珍等[18]的方法，配制含有50%（W/V）甘油、15%乙二醇、15%二甲基亚砜、0.4%蔗糖的最优保护液体系（PSS1）。将花粉置于PSS1保护液中用于单因素以及正交试验。

1.2.1.1MNU浓度对花粉活力的影响 MNU浓度设计 5 个水平：0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。将备用花粉平均分成5份，分别加入不同浓度水平的MNU，室温下避光处理40 min。采用TTC法对处理后的花粉活力进行测定，记录数据。

1.2.1.2 处理时间对花粉活力的影响 将一定量的备用花粉加入到1.0 mmol/L的MNU溶液中，室温下分别避光处理 20，40，60，80，100 min，测定花粉活力。

1.2.1.3 磷酸缓冲液pH对花粉活力的影响 取等量的花粉分别放置于5个培养皿中，将1.0 mmol/L的MNU溶液分别加入培养皿中，将其pH值分别调到 4.2，4.5，4.8，5.1，5.4，室温下避光处理 40 min。测定花粉活力，记录数据。

1.2.1.4 磷酸盐浓度对花粉活力的影响 磷酸盐浓度设计 5 个水平：5，10，15，20，25 mmol/L。各浓度缓冲液取10 ml，分别加入 1.0 g MNU，分别加入等量的花粉，室温下避光处理40 min。测定花粉活力，记录数据。

1.2.2 正交试验 由于各因素之间存在交互作用，因此，有必要设计正交试验以确定最佳高粱离体花粉诱变组合。本试验在单因素结果的基础上，依据正交助手设计了正交试验（表1）。

表1 MNU诱变高粱离体花粉各因素正交试验设计 L9（34）

1.3 高粱离体花粉活力的测定方法

试验采用TTC法测定花粉活力，其主要原理是有活力的花粉呼吸作用产生的NADH2或NADPH2可将无色氯化三苯基四氮唑还原为红色的三苯基甲（TTF）。因此，有活力的花粉被染成红色，无色的花粉即为没有活力或是活力较低的花粉。

2 结果与分析

2.1 MNU处理各因素对高粱离体花粉活力的影响

表2～5分别显示了在其他因素水平为定值的前提下，MNU浓度、处理时间、磷酸盐浓度以及pH值的变化对受处理离体花粉活力的影响。由表2，3可知，受处理花粉的存活率随MNU浓度的增大与处理时间的延长呈现逐渐下降的趋势；其下降速率在 MNU0.5～1.5 mmol/L、处理时间 20～60 min 的范围内相对平缓，当MNU浓度大于1.5 mmol/L、时间大于60 min时下降速率明显增大。

表3 MNU处理时间对高粱离体花粉活力的影响

从表4可以看出，受处理花粉存活率在pH值4.2～4.8范围内，随 pH的增大呈上升趋势，当 pH值为4.8时达到最高，当pH值大于4.8时，又呈下降趋势。

表4 MNU处理液的pH值对高粱离体花粉活力的影响

由表5可知，受处理离体花粉的存活率，随磷酸盐浓度的增加呈现先上升后下降的变化趋势，在磷酸盐浓度为10 mmol/L时达到最大，磷酸盐浓度大于10 mmol/L开始急速减小。总体而言，MNU浓度为 0.5～1.5 mmol/L、处理时间为 20～60 min、pH值为 4.8～5.1、磷酸盐浓度为 5～15 mmol/L 为保持受处理花粉较高活力的适宜条件。

表5 MNU处理液中磷酸盐浓度对高粱离体花粉活力的影响

2.2 MNU处理对高粱离体花粉活力的多因素效应

根据MNU处理单因素对受处理花粉活力的影响，取各因素可保持较高花粉活力的3个水平，进行了多因素正交试验（表6）。

表6 MNU诱变处理对高粱离体花粉活力影响的正交试验结果

多因素效应分析结果表明，MNU处理因素影响离体花粉活力的大小顺序为MNU浓度＞处理时间＞磷酸盐浓度＞pH值，保持最高花粉活力的最优条件组合为MNU浓度0.5 mmol/L、处理时间40 min、pH值 4.8、磷酸盐浓度 10 mmol/L（表 7）。

表7 MNU处理对高粱离体花粉活力的多因素效应

显微观察视野下，与磷酸盐缓冲液处理后相比，最优条件下处理后花粉的胀破现象显著减少，其TTC染色活力状态明显改善（图1）。

3 结论与讨论

基于哺乳动物和微生物细胞MNU处理的诱变表明，MNU作为一种水溶性诱变剂，不仅有高效的基因诱变效应，对微生物体细胞也具有强烈的致癌致死作用[16-17]。通过研究PSS1保护下系列MNU缓冲液处理对高粱离体花粉活力的影响，旨在从影响受处理花粉存活率的诸因素（MNU浓度、处理时间、pH值、磷酸盐浓度）中探求可维持花粉较高活力的适宜条件，以解决MNU诱变处理高粱离体花粉时，花粉极易死亡的问题。在设计水平范围内，受处理高粱花粉的存活率与MNU浓度和处理时间呈负相关，且当MNU浓度大于1.5 mmol/L、处理时间大于60 min时，其存活率下降速率急剧增大，1.5 mmol/L的MNU和60 min的处理时间是高粱花粉细胞忍耐MNU毒性作用的极端敏感条件。高等植物花粉细胞的活力随所处环境pH值波动而变化，起因于H+浓度对花粉结构及其内部酶活性的影响；随所处溶液环境盐离子浓度的改变而变化，起因于环境离子对其渗透压、代谢与形态的影响[19-21]。在设计水平范围内，受处理高粱花粉的存活率，随MNU处理液的pH值与磷酸盐浓度的增大呈先增大后降低的变化规律，当pH值与磷酸盐浓度范围分别为4.8～5.1与5～15 mmol/L时，可维持相对稳定的较高水平，MNU处理液pH值为4.8～5.1与磷酸盐浓度为5～15 mmol/L是高粱花粉细胞可拮抗H+与盐离子影响的适宜水平。MNU处理对高粱离体花粉活力的多因素效应分析结果显示，保持受处理花粉最高活力的最优条件是MNU浓度0.5 mmol/L、处理时间 20 min、磷酸盐浓度 10 mmol/L、pH值 4.8。本研究确立了用MNU缓冲液处理高粱离体花粉的适宜条件与最优条件，解决了高粱花粉生殖细胞基因MNU诱变技术开发的难题。

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