HILIC-HPLC双波长法测定山药中尿囊素和腺苷的含量

朱群英，张亚锋，苏超男，谢锦艳

(1.陕西省药品技术审核查验中心，西安 710065；2.西安市食品药品检验所，西安 710054；3.烟台大学，烟台 264005)

山药是健脾补气的良药，是传统的保健食品，临床上常与胃肠饮同用治疗脾胃虚弱、食少体倦和泄泻等症。山药中含有镁、钠、钾等多种对人体有益的微量元素，淀粉、蛋白质和游离氨基酸等营养成分以及多糖(包括黏液质及糖蛋白)、尿囊素、山药素和腺苷等[1-7]。其中尿囊素不仅有滋润皮肤的作用，还具有局麻和促进皮肤伤口愈合的功能[8-10]；腺苷具有舒张血管、抗心律失常和保护心肌的作用。

尿囊素和腺苷极性很大，在反相色谱柱上保留时间很短，易与极性化合物同时洗脱出色谱柱，导致分离效果不佳[11-12]。亲水性高效液相色谱采用强极性固定相，结合高比例有机相和低比例水相组成的流动相对高极性化合物实现有效分离，对于强极性化合物具有很好的保留和高分离选择性，对中药复杂组分中强极性化合物的分析有较大优势[13-19]。本文采用亲水性高效液相色谱对尿囊素和腺苷实现同时分离与测定，建立山药中尿囊素和腺苷的质量分析方法，该方法简单、灵敏、准确。本方法可为含山药药材、饮片及其制剂质量控制标准的制定提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260型液相色谱仪配置二极管阵列检测器(美国Agilent公司)；KQ-300VDB双频数控型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME204E万分之一电子天平、MS105十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2试药 尿囊素对照品(批号1501-200001)、腺苷对照品(批号110879-200202)，均购自中国食品药品检定研究院。10批山药饮片均购自本市药店，经西安市食品药品检验所谢志民主任中药师鉴定为山药Rhizomadioscoreae，质量符合《中国药典》2015年版一部要求。甲醇、乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Waters XBridge Amide (250 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流动相：乙腈-水(90∶10)；流速：0.5 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；双波长检测：224和260 nm；理论塔板数按照尿囊素峰计算不低于7 000，各色谱峰之间的分离度大于1.5。色谱图见图1。

图1HPLC图

A.对照品(224 nm)；B.对照品(260 nm)；C.样品(224 nm)；D.样品(260 nm)；1.腺苷；2.尿囊素。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance (224 nm)；B.reference substance (260 nm)；C.sample (224 nm)； D.sample (260 nm)；1.adenosine；2.allantoin.

2.2对照品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒质量的尿囊素对照品和腺苷对照品10和6 mg，置于25 mL量瓶中，加入体积分数为90%的乙腈溶解，定容，分别制得含尿囊素和腺苷质量浓度为0.4和 0.24 mg·mL-1的对照品储备溶液。分别精密量取尿囊素储备溶液和腺苷储备溶液20和5 mL，混匀，制备尿囊素和腺苷的质量浓度分别为320和48 μg·mL-1的混合对照品溶液。不同质量浓度的对照品标准曲线工作溶液由体积分数为90%的乙腈按倍数逐级稀释得到。

2.3供试品溶液的制备 取山药饮片粉末0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为90%的乙腈10 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，冷却至室温，加入体积分数为90%的乙腈补足减失的质量，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4线性关系考察 精密量取2.2项下制备的2种对照品储备液适量，用体积分数为90%的乙腈分别稀释成不同质量浓度的对照品溶液。按照2.1项下色谱条件依次进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。

尿囊素的标准曲线:y=4.760 2x+44.629，r=0.999 3，质量浓度在20.12～319.36 μg·mL-1范围内线性关系良好。

腺苷的标准曲线：y=69.181x+130.05，r=0.999 4，质量浓度在3.09～49.12 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5精密度实验 取标准曲线工作溶液，其中尿囊素和腺苷的质量浓度分别为67.07和10.31 μg·mL-1，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，测定尿囊素和腺苷的峰面积和保留时间，分别计算其RSD值，结果尿囊素峰面积和保留时间的RSD值分别为0.88%和0.15%，腺苷的峰面积和保留时间的RSD值分别为1.09%和0.15%，结果表明，仪器精密度良好。

2.6稳定性实验 取4号样品的供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，16和24 h进样，按照2.1项下色谱条件进样，测定尿囊素和腺苷的峰面积，结果二者色谱峰面积的RSD值分别为1.08%和0.99%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7重复性实验 取4号样品，按照2.3项下方法制备供试品溶液，平行6份，按照2.1项下色谱条件测定尿囊素和腺苷的峰面积，计算尿囊素和腺苷含量的RSD值分别为2.35%和2.56%，结果表明，该方法重复性良好。

2.8加样回收率 实验取4号样品粉末0.5 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加入对照品溶液适量，按照2.3项下方法制备供试品溶液，平行6份，进样分析，计算尿囊素和腺苷的加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率测定结果

2.9样品的测定 取10个不同产地山药饮片按照2.3项下方法制备供试品溶液，测定尿囊素和腺苷的峰面积，根据回归方程计算各样品中尿囊素和腺苷的质量分数，结果见表2。

表2样品中尿囊素和腺苷的含量

Tab.2 The contents of allantoin and adenosine in samples

样品尿囊素含量/mg·g-1腺苷含量/mg·g-112．00．94024．20．12032．10．09046．20．22051．70．08561．20．07771．40．08583．00．08192．20．066103．50．130

3 讨论

3.1检测波长的确定 尿囊素和腺苷分别在224和 260 nm波长处有最大吸收，尿囊素在260 nm处不出峰，腺苷在224 nm处响应较小，为了提高检测的灵敏度，采用双波长通道进行测定[20-21]。最终将尿囊素和腺苷的波长分别设定为224和260 nm。

3.2样品提取方法的选择 分别考察不同浓度的甲醇和乙腈作为提取溶剂，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)不同时间，考察对提取效率的影响。结果表明，以体积分数为90%的乙腈作为提取溶剂，超声处理30 min为最佳提取方案。

参考文献：

[1] 袁书林.山药的化学成分和生物活性作用研究进展[J].食品研究与开发，2008，29(3):176-179.

[2] 孔晓朵，白新鹏.山药的活性成分及生理功能研究进展[J].安徽农业科学，2009，37(13):5979-5981，5984.

[3] 李敏.山药活性成分提取技术及药理功能的研究进展[J].南方农业学报，2013，44(7)：1184-1189.

[4] 孙晓生，谢波.山药药理作用的研究进展[J].中药新药与临床药理，2011，22(3):353-封3.

[5] 朱金花，东莹莹，胡卫平，等.高效液相色谱法同时测定怀山药中4个山药素化合物[J].药物分析杂志，2015，35(3):396-400.

[6] 邵礼梅，许世伟.山药化学成分及现代药理研究进展[J].中医药学报，2017，45(2):125-127.

[7] 李锋涛，陈毓.山药的研究进展[J].海峡药学，2008，20(10)：91-93.

[8] 章茹，万义玲，张定亨.尿囊素的性质与应用[J].南昌大学学报：工科版，1997，19(2):81-87.

[9] 樊靓，汤尚文，余海忠，等.山药中尿囊素研究进展[J].现代农业科技，2015，(3):308，317.

[10]孙荣，高艳华，张九勋，等.山药皮中重要功能性成分的研究进展[J].食品与药品，2014，16(3):228-Ⅱ.

[11]王嘉林，王斯坦.HILIC-HPLC-ELSD测定山药中尿囊素的含量[J].中国药师，2015，18(4):582-584.

[12]张亚锋，舒蕊华，王苑桃，等.HPLC-MS/MS法测定山药中尿囊素的量[J].中草药，2014，45(24):3627-3629.

[13]郭志谋，张秀莉，徐青，等.亲水作用色谱固定相及其在中药分离中的应用[J].色谱，2009，27(5)：675-681.

[14]徐露露，陈路晓，骆宜，等.亲水作用色谱在天然产物分离分析中的应用进展[J].药物分析杂志，2016，36(9):1516-1525.

[15]韩超，戴小军，雷根虎，等.强极性中药组分的亲水作用色谱保留行为[J].分析化学研究简报，2010，38(11)：1615-1619.

[16]沈爱金，郭志谋，梁鑫淼.亲水作用色谱固定相的发展及应用[J].化学进展，2014，26(1):10-18.

[17]邓月影，翟金萍，郎爱东.亲水作用色谱在中药极性成分分析中应用进展[J].中药材，2012，35(3)：499-502.

[18]蒲江华，赵峡，韩文伟，等.亲水作用色谱在糖类化合物分析中的应用[J].分析测试学报，2017，36(1)：145-150.

[19]张禄阳，田媛，沈晓航，等.亲水作用色谱在体内药物定量分析中的应用进展[J].中国药科大学学报，2012，43(4):379-384.

[20]蔡艳，宋剑，贾继明.双波长HPLC法建立栀子药材的指纹图谱[J].西北药学杂志，2017，32(2):147-150.

[21]李钰馨，汪永忠，吴小明，等.超高效液相色谱双波长法同时测定黄地安消胶囊中5种成分的含量[J].中国药学杂志，2015，50(4):362-365.