肝细胞癌患者外周血PD-L1基因多态性与肝细胞癌易感性及预后关系研究*

杨 娟，赵 路，刘春梅，吴 涵，曹东辉，赵 琰，张延新，郭 康

肝细胞癌（HCC）是消化系统发病率和死亡率较高的恶性肿瘤[1]。欧洲肝脏病学会和美国肝脏病学会发布的指南推荐的治疗肝细胞癌的方法包括肝切除、经动脉化疗栓塞术、肝移植、局部消融术等[2]，这些方法治疗的患者5 a生存率仍较低[3]。晚期肝细胞癌患者预后较差，化疗和放疗治疗效果有限，主要以姑息性疗法为主，患者中位生存时间短于1年[4]。近些年来，免疫疗法治疗肝细胞癌越来越受到重视，程序性死亡配体（programmed death-ligand 1，PD-L1）是免疫治疗的重要靶点。PD-L1是共刺激分子B7家族的重要成员，由抗原提呈细胞表达，可抑制T淋巴细胞激活[5]。有研究发现，抗PD-L1抗体可以抑制PD-L1的细胞毒性作用，增强T淋巴细胞消灭肿瘤细胞的能力[6，7]。我们对HCC患者外周血PD-L1启动子区、编码区和非编码区的3个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）， 即 rs4143185、rs17718883和rs2890658进行了分析研究，以探讨PD-L1与肝细胞癌易感性和患者预后的关系，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年1月～2015年6月诊治的HCC患者100例，均经血清学、影像学和组织病理学检查诊断。纳入患者在采集血清前未接受过抗肿瘤治疗，无自身免疫性疾病史，无其他恶性肿瘤病史。另选100例肝功能正常的正常人群作为正常对照。本研究经过本院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 血液PD-L1基因多态性检测 在清晨空腹采血5 mL，置于EDTA抗凝管中，冻藏于-80℃。使用E.Z.N.A.Blood DNA试剂盒（杭州希顿生物科技有限公司）提取全基因组DNA，取全血600 μl，加入1.5 ml EP管，加入红细胞裂解液900μl、混匀，室温下5000 g离心，3 min，加入WTL细胞裂解液 250μl，孵育 1 h，加入 BL 缓冲液 250μl，孵育10 min，再加入无水乙醇250μl，混匀，将混合液加入DNA结合柱中，8000 g离心，1 min。加入洗液500μl，8000 g离心，1 min，重复清洗1次。去除洗液，将预热的Elution缓冲液60μl加入DNA结合柱的膜上，室温放置10 min，12000 g，离心2 min，将DNA样本放置于-80℃冰箱保存。采用直接测序法和聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）检测基因多态性。在单核苷酸多态性数据库（dbSNP）选择PD-L1基因3个SNP位点：即rs2890658、rs17718883和 rs4143185。本实验目的基因引物均由上海生物工程有限公司设计（表1）。PCR 反应体系如下：依次将 buffer（5μl），MgCL（22μl），模板DNA（2 μl），dNTP（2μl），上游和下游引物各 1μl，DNA 聚合酶（0.2μl），去离子水（9.8 μl）加入 0.5 mL 的 EP 管中、混匀，在 4℃离心机（美国贝克曼）3000 g下离心30 s，然后置入PCR仪（日本TAKARA）上扩增，预变性（rs2890658:95℃ ，10 min；rs17718883：95 ℃ ，3 min；rs4143185：94℃ ，5 min）， 变 性（rs2890658:95℃，30 s；rs17718883：94 ℃，1 min；rs4143185：94℃，20 s），5 个循环，退火（rs2890658:60℃，30 s；rs17718883：55℃ ，1 min；rs4143185：55 ℃ ，30 s），延伸（rs2890658:72℃，3 min；rs17718883：72℃，1 min；rs4143185：72℃，1 min），35 个循环，延伸（rs2890658:72℃ ，10 min；rs17718883：72℃ ，1 min；rs4143185：72℃，7 min）。随机抽取 5%DNA样品，委托上海联硕生物科技有限公司使用美国ABI-3500基因测序仪测序，DNA测序结果与PCR检测结果重合率为100%。

表1 引物序列

1.3 随访 对所有患者进行电话随访。进展生存期时间定义为肿瘤患者从接受治疗开始，到观察到疾病进展或者发生因为任何原因的死亡之间的时间。总生存时间（OS）定义为自确诊之日到死亡的时间。死于其他原因的患者作为截尾事件。随访时间为10～48个月，中位时间为20个月。

1.4 统计学分析 应用SPSS 20.0进行统计学分析，对符合正态分布的计量资料以±s表示，采用t检验，对不符合正态分布的计量资料以【M（IQR）】表示，采用秩和检验，采用x2检验分析肝细胞癌患者和正常人基因型分布是否符合哈迪-温伯格平衡。Logistic回归分析结果以比值比（OR）和95%可信区间（CI）表示，采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验计算无进展生存期（PFS）和OS。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 肝细胞癌患者和正常人一般资料见表2。

表2 两组一般资料（%）

2.2 PD-L1基因SNP与肝细胞癌易感性关系 正常人PD-L1基因频率符合哈迪-温伯格平衡定律，具有群体代表性（表3）。PD-L1基因rs17718883位点与肝细胞癌易感性有关（P＜0.05），在对年龄、性别、家族史进行校正后发现，rs2890658的AC杂合突变基因可以降低肝细胞癌的发病风险（P＜0.05），rs17718883的CG杂合突变基因也会降低肝细胞癌的发病风险（P＜0.05），其余基因型与肝细胞癌的易感性之间无明显相关性（P＞0.05，表4）。

表3 正常人3个SNP基因频率（%）

表4 两组人群3个SNP基因型的分布和风险评估[n（%）]

2.3 PD-L1基因SNP与患者预后相关性 rs2890658位点的3个基因型AA、AC和CC患者中位生存时间差异无统计学意义（P＞0.05，图1左上），合并基因型AC和CC者，中位生存时间为20个月，明显比AA基因型者长，差异有统计学意义（P＜0.05，图1右上）；，4143185位点的 3个基因型 CC、GC、GC患者中位生存时间差异有统计学意义（P＜0.05，图1左下），合并GC和CC者，中位生存时间明显长于CC者，差异有统计学意义（P＜0.05，图1右下）。COX回归分析显示，rs4143185突变基因型者预后较好（P均＜0.05），其余基因型者预后无显著性统计学差异（P均＞0.05，表5）。

图1 不同PD-L1基因型患者生存曲线 rs2890658位点基因型患者生存曲线（左上和右上）；rs4143185位点基因型患者生存曲线（左下和右下）

3 讨论

2014 年，世界卫生组织在《世界癌症报告2014》中指出，2012年中国新增HCC病例数和死亡病例数均占全球新增病例数和死亡病例数的一半以上。在2012年，我国新增HCC病例394770例[8]。HCC的病因多样，具体机制到目前为止尚未明了[9]。免疫疗法逐渐应用于HCC患者的治疗。PD-L1作为免疫治疗的主要靶点越来越受到重视。

已有研究表明，PD-L1基因与乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌等与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等的发病风险有关[10，11]。在人体正常免疫系统中，PD-L1对于维持机体免疫平衡至关重要。而在肿瘤微环境中，PD-L1表达上调，激活了PD-L1/PD-1 通路，从而介导肿瘤的免疫逃逸[12，13]。此外，PD-L1能够诱导T细胞无能和耗竭、肿瘤相关性抗原提呈细胞功能缺失、调节T细胞来源的抑制性细胞聚集等[14]。

表5 不同PD-L1基因SNP患者总生存时间【M（IQR）】比较

很多国外研究显示，PD-L1多态性与胃癌、非小细胞肺癌、结肠癌等有关[15-17]。本研究发现，rs17718883位点与HCC的易感性相关。多元回归分析发现，rs2890658 AC突变型基因可能会降低HCC的发病风险，而rs4143185 GG突变型基因会增加HCC的风险。本研究结果与程仕光等研究一致[18]。携带rs2890658位点的3个基因型，即AA、AC和CC者中位生存时间在19个月左右，而合并AC和CC基因型者，中位生存时间延长。合并rs4143185位点GC和CC基因型者中位生存时间明显长于携带CC者,结果表明rs4143185和rs2890658两个位点突变型均可延长患者生存时间。但是，经回归分析发现仅rs4143185与患者生存时间相关，与有关研究结果一致[19]。rs4143185位点位于 PD-L1的 3’UTR上，该位点 SNP会影响PD-L1的表达，降低PD-L1/PD-1受体与配体的结合，激活T淋巴细胞对癌细胞的免疫杀伤，控制癌细胞生长，进而延长患者的生存时间。rs2890658位于内含子区，对于PD-L1基因的表达影响较小[20]。

本研究的局限性在于：1）样本量较小，使得研究结果需要扩大验证；2）本研究为回顾性研究，未来需要队列研究来证实本研究的结果；3）这三个基因位点具体如何发挥作用还需要进一步探讨；4）本研究未对PD-L1基因多态性与治疗手段进行相关性分析。有研究发现[21]，PD-L1基因rs2301113位点可以作为HCC患者独立的预后指标。这方面是本课题组今后研究的重点内容。

PD-L1基因rs2890658位点和rs17718883位点SNP与HCC易感性有关，而rs2890658位点和rs4143185位点SNP可能与HCC患者预后有关。

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