慢性丙型肝炎外周血miR-1273g-3p水平变化及其诊断肝纤维化分期的效能分析*

王婧婧，张瑜，董娜，韩振坤，翟景明

随着分子生物学的发展，有关肝纤维化的研究重点逐渐转移至与纤维化发生相关的基因研究上，如MicroRNA（miRNA）是一种非编码单链RNA，长约22 nt[1-5]。在静息状态下，人类HSC与激活后的HSC存在miRNAs水平差异[6]。本研究检测了慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）患者外周血miR-1273g-3p水平变化，并分析了其与肝纤维化分期的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年2月～2017年2月我科收治的CHC患者57例，男35例，女22例；年龄20～52岁，平均年龄（36.1±7.8）岁。符合《慢性丙型肝炎防治指南》的诊断标准，排除甲型、乙型、戊型肝炎病毒和HIV混合感染者，排除酒精性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝病，排除合并严重的内分泌系统、脑血管系统疾病和恶性肿瘤、预计生存期短于4个月患者。另选择同期在我院健康体检者21例作为对照，男性15例，女性6例；平均年龄（35.2±5.6）岁。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有受试者签署相关知情同意书。

1.2 肝穿刺活检术 嘱患者取平卧位或左侧卧位，在B超引导下选择穿刺点和进针途径，先后取出肝组织2～3条，置入10%甲醛溶液中固定、送检。在肝组织病理学检查时，采用Metavir评分判断肝纤维化程度，F0：无纤维化；F1：局限性汇管区纤维增生，窦周和小叶内纤维化；F2：纤维化扩大至汇管区周围，伴纤维间隔形成，肝小叶结构保留；F3：纤维间隔形成伴小叶结构紊乱，无肝硬化；F4：早期肝硬化。

1.3 治疗方法 给予患者长效干扰素-α2b联合利巴韦林标准疗法治疗12 m。

1.4 临床检测 抽取空腹外周静脉血5 ml，常规检测血生化、抗-HCV和HCV RNA。

1.5 血清miR-1273g-3p水平测定 采集所有待检人员外周静脉血3 ml，分离血浆，在4℃下12000 r/m离心12 min，吸取血清250μl，加入1.5 ml Eppendorf离心管，加入相关内参对照和试剂，在漩涡器上充分混匀，放置5 min，使用改良的miRNA提取方法提取miRNA，并测定其纯度和浓度。测定完毕后，行逆转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测，本研究所用引物序列见表1。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料以（±s）表示，采用 t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。采用Spearman秩相关分析miR-1273g-3p水平与肝纤维化分期的相关性。绘制受试者工作特征曲线（ROC）并计算miR-1273g-3p曲线下面积，评价其诊断肝纤维化分期的效能。

表1 引物序列

2 结果

2.1 CHC患者与健康人血清miR-1273g-3p水平比较 与健康人比，存在肝纤维化的CHC患者血清miR-1273g-3p水平显著升高，而显著肝纤维化患者血清miR-1273g-3p相对水平显著高于轻度肝纤维化患者（P＜0.05，表2）。相关性分析结果显示，CHC患者血清miR-1273g-3p水平与肝纤维化分期呈正相关（r=0.657,P＜0.001）。

2.2 CHC患者血清miR-1273g-3p相对水平变化 在抗病毒治疗12 m末，CHC F0期、F1-2期和F3-4期患者血清miR-1273g-3p相对水平依次变化为（1.03±0.4）、（1.43±0.22）和（3.97±0.2），均显著低于治疗前（P＜0.05）。

表2 CHC患者与健康人血清miR-1273g-3p水平（±s）比较

表2 CHC患者与健康人血清miR-1273g-3p水平（±s）比较

与健康人或CHC F0期比，①P＜0.05；与F1-2期比，②P＜0.05

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2.3 血清miR-1273g-3p水平诊断肝纤维化分期的效能分析 在治疗前，分别以血清miR-1273g-3p水平＞1.68和血清miR-1273g-3p水平＞4.20为截断点诊断存在肝纤维化和显著肝纤维化，其ROC曲线下面积（AUC）分别为 0.830，95%CI为0.714～0.973，诊断的灵敏度为72.2%，特异度为86.4%，和0.864，95%CI为 0.701～0.976，诊断的灵敏度为83.6%，特异度为78.4%（图1）；在治疗后，经肝组织病理学检查发现CHC患者F0期、F1期、F2期、F3、F4期依次为 15例、9例、14例、11例、8例。血清miR-1273g-3p水平诊断存在肝纤维化和显著肝纤维化的AUC分别为0.814，95%CI为0.768～0.945，诊断的灵敏度为71.4%，特异度为82.7%，和为0.853，95%CI为0.841～0.959，诊断的灵敏度为80.3%，特异度为84.2%（图2）。

图1 血清miR-1273g-3p诊断肝纤维化的效能分析（治疗前）

图2 血清miR-1273g-3p诊断肝纤维化的效能分析（治疗后）

3 讨论

人类miRNA家族包含1424种前体编码的1733种成熟miRNA。虽然miRNA序列数量仅占人类基因序列的1%～3%，但参与近1/3基因水平的调控，在机体生长发育、细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生中发挥着重要的作用[8，9]。近年来，众多研究[10，11]发现miRNA在肝脏分化、形态维持和功能维护中发挥重要的作用。另有最新研究显示[12]，miRNA分子不仅存在于细胞中，还可出现在循环中。miRNA对RNA酶的降解反应稳定，可作为活跃的生物学标志物，但不同疾病血清miRNA分子水平不同，不同组织的miRNA分子具有组织特异性，故通过研究血清/血浆miRNA分子水平以评估患者病情发展将成为可能。

CHC的发生主要通过输血、静脉注射、生活密切接触等方式传播，感染率约为3%，其中CHC约占感染总数的70%～85%[13]。随着肝炎的进展，部分CHC可发展为肝硬化，甚至肝癌，因早期肝纤维化是可逆的，故临床强调早期诊断病情并予以积极治疗可促进患者康复，避免肝硬化和肝癌发生[14，15]。肝组织病理学活检是诊断肝纤维化的金标准，但属于有创检查，且肝组织纤维化分布不均，无法全面地评估病情发展，导致肝组织活检存在一定的局限性[16]。

随着分子生物学研究的深入，研究发现多种慢性肝脏疾病均伴miRNA的水平差异，如药物性肝损伤、病毒性肝炎、酒精性肝病等，miRNA调控的靶基因，包括转化生长因子β1、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶抑制剂等多种细胞因子均可表现为不同[17]。转化生长因子β/Smad可以抑制正常肝细胞的增殖，激发肝星状细胞（HSC）激活，促进ECM的生成与沉积。另一反面，转化生长因子β/Smad信号通路可导致细胞基质金属蛋白酶和金属蛋白酶组织抑制因子上调，从而导致ECM降解降低。在组织纤维化过程中，转化生长因子β/Smad信号通路的激活又可促进一些纤维化因子的活化，如血管内皮生长因子和整合素等。因此，miRNA在转化通路中发挥重要的作用[18-20]。CHC患者血清转氨酶水平与干扰素应答基因呈正相关[21]，通过对比活化型HSCs与静息型HSCs miRNA水平，发现HSCs活化过程中明显上调的基因包括 miR-125b、miR-132 和 miR-1273 等[22]，并有学者采用双荧光素酶报告基因检测验证了miR-1273g-3p与PTEN特异性结合，提出miR-1273g-3p可能通过调控PTEN来参与肝纤维化的进展[23]。基于上述研究，本课题组检测了不同肝纤维化程度的CHC患者血清miR-1273g-3p水平，结果发现健康人与F0期CHC患者血清miR-1273g-3p相对水平无显著性差异，但存在肝纤维化的F1-2期组和F3-4期组血清miR-1273g-3p相对水平显著升高，且F3-4期组水平最高，显示出随着肝纤维化的发展，血清miR-1273g-3p水平逐渐上升。经绘制ROC曲线分析，并计算ROC曲线下面积，结果显示血清miR-1273g-3p相对水平具有一定的诊断肝纤维化的效能，无论在治疗前还是经抗病毒治疗后的CHC患者，血清miR-1273g-3p相对水平均与肝纤维化程度呈正相关。在治疗前，分别以血清miR-1273g-3p水平＞1.68和血清miR-1273g-3p水平＞4.20为截断点诊断存在肝纤维化和显著肝纤维化，其ROC曲线下面积（AUC）分别为0.830，95%CI为0.714～0.973，诊断的灵敏度为72.2%，特异度为86.4%，和 0.864，95%CI为 0.701～0.976，诊断的灵敏度为83.6%，特异度为78.4%。在治疗后，其结果也类似。由此可见，临床医师可把循环血miR-1273g-3p水平作为诊断肝纤维化分期的参考指标之一。

总之，循环血miR-1273g-3p水平可有效反映肝功能损害和肝纤维化程度，监测其血清水平将有助于对肝纤维化的诊断及分期判断。但鉴于本研究样本小，检测方法还不稳定，可能在一定程度上影响了本研究结论的可靠性。在以后的研究中，还需要扩大样本量，并与其他疾病检测结果相比较，以充分论证血清miR-1273g-3p水平对肝纤维化的诊断价值。

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