不同处理方法对芜菁游离小孢子出胚率的影响

贾 凯，吴 慧，许 建，高 杰

（新疆农业大学林学与园艺学院，新疆乌鲁木齐830052）

芜菁（Brassica rapa L.）属十字花科芸薹属2年生根菜类蔬菜。在新疆维吾尔语中称恰麻古，是维吾尔族居民食药两用的传统蔬菜［1］。目前，新疆地区所栽培的芜菁品种混杂，多为农户自行留种后育成的农家品种，由于这些农家品种存在提早抽薹现象严重且容易遭受病虫害，因此选育新的杂交品种已成为芜菁育种的主要方向。选育新的杂交品种需要纯合的亲本进行杂交，获得纯合的亲本一般通过常规技术进行多代自交，此方法耗时长、效率低。利用游离小孢子培养方法，可在1～2年内获得稳定的纯合自交系，缩短育种周期，提高育种效率［2］。因此，游离小孢子培养技术是芜菁育种的一条有效途径。

有关游离小孢子培养技术方面前人做了许多研究，其中，Lichter利用小孢子培养技术首次在甘蓝型油菜上成功地获得再生植株［3］；Sato等通过大白菜游离小孢子培养形成双单倍体植株用于育种［4］；Takahata等对3种花青菜的供体植株进行低温处理，然后再进行小孢子培养获得胚状体［5］；蒋武生等对芜菁小孢子热激处理后培养获得胚状体［6］；乔丽桃等对芜菁花蕾长度与小孢子单核靠边期的关系进行初步探究，并观察了芜菁小孢子胚胎发生的显微结构［7］；王娜等研究了芜菁花蕾大小与小孢子发育时期、小孢子胚胎发生率的对应关系［8］，但在试验过程中发现，芜菁胚状体发生率较低，这为后续试验的进行带来不便。因此，本试验对芜菁小孢子胚状体发生过程中的影响因素进行研究，以提高芜菁小孢子出胚率，从而为新疆芜菁的遗传育种研究提供基础条件。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料来源于新疆柯坪县当地农家芜菁品种阿恰芜菁。2015年8月于新疆农业大学林学与园艺学院试验田中种植芜菁材料，将收获的芜菁肉质根置于4℃低温下保存。2016年4月21日将已经通过低温春化的肉质根种植于露地，5月8日植株陆续抽薹开花，植株生长环境温度范围为12～26℃。

1.2 试验方法

1.2.1 花蕾的采集与处理 于每日 08：00—10：00（采蕾环境温度范围为15～18℃）随机摘取供试植株的主花序或一级分枝花序放入培养皿中，置于放有冰袋的泡沫箱中及时带回组培实验室。将花序上的花蕾轻轻用镊子取下，选取处于单核靠边期的花蕾［8］（约2.0～3.0mm）转移到2%NaClO（含2滴吐温乳化剂）中消毒10 min，再用无菌水冲洗3次，每次5 min。花蕾消毒及小孢子游离与培养的整个试验过程均在无菌条件下完成，且所用试验工具及液体都经灭菌后置于4℃条件预冷。

1.2.2 小孢子的游离与培养 将消毒过的花蕾置于烧杯中，并加入1 mL B5洗涤培养基（pH值5.8），用注射器活塞压榨花蕾，释放小孢子，通过45μm尼龙筛网过滤小孢子悬浮液。将收集的滤液用B5培养基定容至5 mL，4℃、800 r／min离心5 min，之后倒掉上清液，留下沉淀，再倒入5mL B5培养基，重新悬浮小孢子并离心，共离心3次。最后，将收集到的小孢子用1 mLNLN培养基制成悬浮液，调整小孢子密度为10万～20万个／mL，分装至直径为60 mm的培养皿中，每皿约3 mL，用Parafilm膜封口。

1.2.3 不同处理方法对小孢子胚胎发生率的影响 小孢子的高温热激处理：将不添加激素的NLN－13小孢子悬浮液放入恒温箱中黑暗静置培养，分别设置25℃（CK）、33℃、35℃共3种温度和24、48、72 h共3种时间的热激处理，随后转到25℃继续黑暗静置培养。

不同蔗糖浓度的培养基培养：分别用 NLN－9（蔗糖9%）、NLN－13（蔗糖13%）（CK）、NLN－15（蔗糖15%）3种不同蔗糖浓度且不含激素的NLN液体培养基悬浮培养小孢子，随后分装于60 mm培养皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。经33℃、24 h热激处理后转到25℃黑暗静置培养。

培养基中添加6－BA和NAA培养：将小孢子沉淀物均匀悬浮于含有不同浓度 NAA（0.1、0.2、0.4 mg／L）、6－BA（0.1、0.2、0.4 mg／L）激素含量的 NLN－13培养基中，并分装于60 mm培养皿中，每皿3 mL，Parafilm膜封口。以不添加任何激素的NLN－13培养基作为对照组（CK）。经33℃、24 h热激处理后转到25℃黑暗静置培养。

1.2.4 胚状体的观察 以上试验每个处理均取20个花蕾。培养30 d后统计产胚量，并将形成的小孢子胚转入固体培养基中培养。在培养过程中使用倒置显微镜观察小孢子的变化，采用 Duncans新复极差法进行产胚量间差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 不同热激温度、时间处理对芜菁胚状体发生的影响

由表1可知，在其他培养条件相同的情况下，25℃（CK）条件下恒温培养未出现胚状体；热激温度为33℃、时间为24 h时，出胚率最高，为1.25胚／蕾，48 h后胚诱导率降至0.60胚／蕾，72 h后胚诱导率仅为0.05胚／蕾；当热激35℃、时间为 24 h时，胚诱导率为 0.35胚／蕾，48 h时为 0.20胚／蕾。本研究过程中还发现，33℃培养条件下形成的胚状体中子叶形胚比率最高，达到94.5%；而35℃时，子叶形胚比率仅为63.6%，这可能是由于热激温度过高，不适于小孢子的发育。有研究认为，热激时间以24 h为出胚率最高，小孢子培养的前12 h是小孢子分裂的敏感期，而胚胎发生的敏感期在开始培养的24 h内［9］。由此可见，热激处理对于芜菁的小孢子胚胎发生是必需的，本研究得出33℃、24 h的热激处理适用于芜菁游离小孢子培养。

表1 不同热激温度、时间处理对芜菁胚状体发生的影响

2.2 不同蔗糖浓度对芜菁胚状体发生的影响

蔗糖在小孢子培养的过程中调控着培养基的营养成分和渗透压［10］。由表2可知，13%蔗糖浓度（NLN－13）诱导率最高，为1.25胚／蕾；在蔗糖浓度为15%（NLN－15）时，出胚量相对较少，平均为0.85胚／蕾；蔗糖浓度为9%（NLN－9）时，未出现胚状体。结果表明，当蔗糖浓度为13%（NLN－13）和15%（NLN－15）时能够诱导出胚状体，但13%（NLN－13）的蔗糖浓度最适于芜菁小孢子的胚胎发生。

表2 不同蔗糖浓度对芜菁胚状体发生的影响

2.3 不同激素配比对芜菁胚状体发生的影响

由表3可知，NLN－13培养基中单独添加6－BA时，小孢子胚诱导率较CK并无显著提高；添加0.1 mg／L 6－BA时出胚率相对最高，达到2.10胚／蕾；高浓度的6－BA有抑制胚状体的现象发生，当6－BA浓度为0.4 g／L时，出胚率降低到0.6胚／蕾，在所有激素处理中处于最低水平。培养基中单独添加NAA时，出胚率显著高于CK，随NAA浓度增加，出胚率呈先上升后下降的趋势，当NAA浓度为0.2 mg／L时达到最高，为8.60胚／蕾，是 CK的4.7倍，添加0.2 mg／LNAA是所有处理中能最有效提高出胚率的方法。在培养基中同时添加NAA与6－BA时，出胚率有小幅提升；当同时添加0.2 mg／L NAA和0.2 mg／L 6－BA时，芜菁小孢子的胚胎发生率达到最高，为3.15胚／蕾；增大NAA与6－BA浓度分别到0.4 mg／L时，胚诱导率下降到1.10胚／蕾。在培养基中加入激素能有效地提高小孢子胚胎发生的频率，但是加入激素后，胚状体的发育状况也受到影响。单独添加6－BA的处理中，所诱导出的胚状体发育不完全，畸形胚数量相对较少；单独添加0.2 mg／L NAA时，子叶形胚占胚状体总数的比率相对较高，达到72.1%；当NAA浓度为0.4 mg／L时，子叶形胚比率下降到 52.3%。综上所述，在培养基中单独添加0.2 mg／L NAA可以有效提高芜菁小孢子胚诱导率，且子叶形胚比率相对较高。当在培养基中同时添加NAA与6－BA时，并不能使小孢子胚胎发生与发育朝着良好的方向发展。

2.4 小孢子离体发育过程

从图1可以看出，小孢子的膨大情况各不相同，同一处理中出现了膨大的小孢子和未有变化的小孢子（图1－A）；随着培养时间的增加，小孢子形成细胞团（图1－B）；细胞团发育成为胚状体的过程为球形胚－鱼雷形胚－心形胚－子叶形胚（图1－C、图1－D、图1－E、图1－F）；未含激素的培养基中产生的小孢子胚发育状况良好（图1－G）；添加激素后小孢子胚胎数明显增多，但胚状体发育情况各异，出现较多畸形胚（图1－H）；胚状体转接至固体培养基后转绿（图1－I）。将小孢子胚接种于 B5＋0.2 mg／L 6－BA ＋0.05 mg／L NAA固体培养基上，胚状体逐渐转绿并开始萌发，胚状体萌发后形成较多幼芽。然后将幼芽转入B5＋0.2 mg／L NAA生根培养基上可以生根，形成完整植株。

3 结论与讨论

目前游离小孢子培养技术在大多数蔬菜的育种工作中都得以运用，本试验在已确定小孢子处于单核靠边期时花蕾大小的对应关系后，主要针对南疆地区主栽农家芜菁品种阿恰芜菁进行诱导，探究小孢子出胚的最适条件以获得更多数量的双单倍体纯合植株。

高温热激处理可以改变小孢子的发育途径，使其不能形成成熟的花粉粒转而向胚胎发育的途径发展，形成小孢子胚［11］。本研究认为，33℃、24 h的高温热激处理对芜菁小孢子胚胎发生是必要的，出胚率为1.25胚／蕾，而且小孢子胚的生长状况良好，多数可发育成子叶形胚。培养基中的蔗糖一方面维持着小孢子生长发育所需要的营养物质，另一方面调节着培养基中的渗透压［12－13］。在诱导油菜、大白菜等小孢子胚状体过程中发现，当NLN培养基中的蔗糖浓度为13%时，小孢子胚的发生与发育状况最好［14］，这与本研究所得结论一致。蒋武生等研究发现，不含任何激素的NLN培养基有利于胚状体的发育［15］；朱守亮等在 NLN－13培养基中添加0.1 mg／L 6－BA和 0.05 mg／L NAA能够诱导出高胚产量［16］；李岩等研究发现，NLN培养基中加入0.05mg／LNAA和0.05mg／L 6－BA的胚诱导率显著高于不加入任何激素的NLN培养基［17］；戴希刚等在进行羽衣甘蓝的小孢子培养试验中发现，6－BA对胚胎发生有抑制作用［18］。本试验结果表明，在NLN培养基中单独添加0.2 mg／L NAA可以显著提高小孢子出胚数，单独添加低浓度的6－BA能够促进芜菁小孢子胚的发生，但效果不如NAA明显，混合加入NAA与6－BA对小孢子胚的产生无明显作用。同时研究发现，添加激素后小孢子的胚胎发育受到一定影响，培养过程中出现畸形胚，胚状体到一定时期并不会再向着子叶形胚发展。本试验研究认为，采用33℃热激处理24 h时，在NLN－13中加入0.2 mg／L NAA是芜菁游离小孢子的胚胎发生与发育的最佳条件。

表3 不同激素浓度对芜菁胚状体发生的影响

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