HPA及NRF2与喉鳞状细胞癌发生和发展的相关性研究

邱新峰，程万民

(天津市第五中心医院耳鼻喉科 300450)

喉鳞状细胞癌是较为常见的口腔上皮恶性肿瘤，临床预后较差。流行病学研究显示，喉鳞状细胞癌的发病率为0.5%～1.7%，在部分地区的发病率更高，可上升3～4倍[1]。近年来基础领域的研究显示，生物学因子的改变可影响喉鳞状细胞的增殖、癌细胞的侵袭或转移等病理过程，促进早期上皮性恶性肿瘤的进展[2-3]。乙酰肝素酶(heparanase，HPA)能够分解细胞外基质，为癌细胞的转移提供条件，而核因子E2相关因子2(NF-E2 associated factor ，NRF2)能够影响到氧化应激损伤或者氧自由基的传递，促进早期鳞状细胞的病变[4]。为了进一步揭示HPA及NRF2与喉鳞状细胞癌发生、发展的相关性，本研究收集2015年2月至2017年2月本院保存的喉鳞状细胞癌标本81份，观察二者的异常表达，研究其与患者临床病理特征间的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年2月至2017年2月本院保存的喉鳞状细胞癌标本81份(病例组)，标本来源患者中男52例，女29例,平均年龄(51.42±8.92)岁。纳入标准：(1)患者临床病理资料保存完整；(2)经病理确诊为喉鳞状细胞癌；(3)术前未接受过放化疗等治疗；(4)患者及家属知情同意并签署同意书。排除标准：(1)临床病理资料不完整；(2)合并其他原发性肿瘤。同时选取声带息肉病理标本77份(对照组)，标本来源患者中男42例，女35例，平均年龄(50.89±9.10)岁。两组受试者年龄、性别比较差异无统学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1免疫组织化学法 采用石蜡切片脱蜡至水，切片厚度3 mm，3%H2O2室温孵育5 min，采用去离子水冲洗3次，每次3 min，采用浓度为10%牛奶蛋白(1 g蛋白加入100 mL纯水)封闭，室温孵育5 min，加入HPA抗体(鼠来源，购自南京碧云天生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次5 min，滴加HRP标记的二抗(兔来源，购自罗氏检测公司)，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，然后加入硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(NBT/BCIP)色剂显色5 min，复染，脱水，透明，封片，镜下观察。OLIPICS电子显微镜购自上海精密仪器有限公司，配套试剂购自南京泰康生物科技有限公司。

1.2.2Western blot检测 冰上分离出组织，置于预冷的研钵中液氮研磨至粉末状。冰上静置60 min，室温下20 000 r/min离心60 min，取出下层沉淀。按总蛋白80 g计算上样容积，按照比例为3∶1或者4∶1的比例上TBS缓冲液，加入20 μL缓冲液后于45 V电压下进行电泳操作，脱脂蛋白封闭2 h，加入NRF2抗体(鼠来源，购自南京碧云天生物科技有限公司)各10 μL后室温下孵育2 h，2 h后加入二抗(兔来源，购自南京凯基生物科技有限公司)。采用日本Panasoic公司生存的HSO-900系统影像分析仪器进行图像分析。

1.2.3免疫组织化学结果判断 HPA阳性表达主要定位于细胞质和细胞膜，呈棕黄色染色。每张切片选取5个高倍镜视野，将阳性细胞比例及染色强度分为4个等级，分别对应0、1、2、3分。其中阳性细胞比例小于25%为0分，≥25%～<50%为1分，≥50%～<75%为2分，≥75%为3分；无染色为0分，浅黄色为1分，橘黄色为2分，棕黄色为3分。将阳性细胞比例及染色强度得分相加后除2得出最终分数，其中得分小于1.5分为阴性，≥1.5分为阳性。

2 结 果

2.1两组HPA及NRF2表达比较 病例组和对照组的HPA阳性表达率和NRF表达量分别为81.48%、19.48%和0.844±0.113、0.202±0.094，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。

图1 Western blot检测图

A:病例组(SP,×400)；B：对照组(SP,×200)

图2两组HPA阳性表达免疫组织化学图

2.2患者HPA阳性表达与病理特征的关系 不同年龄、性别和病灶部位患者HPA阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)；有无淋巴结转移，不同的病理分化、TNM分期患者HPA阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 患者HPA阳性表达与病理特征的关系

续表1 患者HPA阳性表达与病理特征的关系

2.3患者NRF2表达与病理特征的关系 不同年龄、性别和病灶部位患者NRF2表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；有无淋巴结转移，不同的病理分化、TNM分期患者NRF2水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 患者NRF2水平与病理特征的关系

3 讨 论

喉鳞状细胞癌的发生主要考虑与遗传、吸烟或者放射性因素等有关，特别是在吸烟人群中，喉鳞状细胞癌的发病率高于55%[5]。喉鳞状细胞癌的临床预后较差，5年生存率小于36%，中位生存时间不足36个月[6-7]。一项样本量为334例，且临床分期为中晚期的喉鳞状细胞癌治疗随访研究显示，疾病的治疗总体有效率小于30%，治疗后的复发率及远处转移率较高[8-9]，病死率持续性维持在较高的水平[10]。对喉鳞状细胞癌发生、发展过程中相关生物学机制进行研究，不仅可以为喉鳞状细胞癌的生物学靶向治疗提供参考，还可以为喉鳞状细胞癌的临床预后随访提供可靠的实验室指标。

HPA的结构上包含了3～4个糖蛋白配体结构，能够在结合细胞外基质的同时促进其分解，通过分解细胞外胶原纤维Ⅳ或者胶原纤维Ⅴ等，降低细胞间的紧密连接程度，为癌细胞的早期增殖或者转移提供空间；NRF2能够在细胞水平影响到氧化应激代谢，促使氧自由基传递异常导致的细胞氧化损伤，以及喉鳞状上皮早期增殖调控异常，影响到癌细胞的持续性病变的发生[11-12]。已有的研究探讨了NRF2及HPA等在喉癌患者中的异常表达，但缺乏对于其与患者临床病理特征间的关系研究，此为本次研究的创新点。

本次研究发现，喉癌组患者的病灶组织中HPA及NRF2表达水平均明显高于正常对照组织，提示HPA及NRF2二者可能参与到了喉鳞状细胞癌的早期发生过程，HPA及NRF2的高表达可以从下列两个方面影响到喉癌的进展：(1)HPA的高表达能够提高癌细胞的早期变形及突破基底膜的能力，促使其早期临床分期的进展；(2)NRF2的高表达能够使三磷酸腺苷(ATP)能量代谢利用障碍，促进线粒体氧化应激异常，导致喉鳞状细胞的细胞增殖调控紊乱。有研究者在探讨喉癌患者的发病机制的过程中发现，HPA及NRF2在喉癌患者血清及病灶组织中均存在一定程度的异常表达，且相关表达水平越高，患者病情越重、临床远期预后越差[13-14]。在探讨不同的临床特征与生物学因子的关系过程中发现，有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者HPA阳性表达率更高，提示HPA可显著影响到淋巴结的转移等病理过程。从机制上考虑HPA对于相关临床病理特征的影响主要为：(1)HPA促进了癌细胞对于淋巴结内皮细胞的黏附能力，提高了其通过淋巴结转移的风险；(2)HPA能够影响到癌组织对于临床正常口腔组织或者器官的浸润，促进临床分期的进展。同时本研究发现HPA可以显著影响到癌细胞的分化程度，加剧癌细胞分化不良或者低分化的风险。在探讨NRF2与喉癌患者临床特征的关系过程中，本研究也发现NRF2与患者的淋巴结转移、临床分期等特征具有明显的关系，这些均提示了NRF2等与喉癌病情有密切联系。HPA及NRF2可能在下列两个方面发挥了一定的协同作用，从而促进了喉癌特别是鳞状细胞癌的发生：(1)HPA及NRF2的高表达均可能影响乙酰基团的修饰及羧基末端的空间结构，干预喉癌上皮细胞的增殖、分化；(2)HPA及NRF2的协同表达可能影响核转录因子的转录活性，增加癌细胞DNA异常增殖的风险。但更为具体的内在机制的探讨，仍然需要后续基础研究证实。

综上所述，喉鳞状细胞癌患者HPA及NRF2表达明显升高，与淋巴结转移、TNM分期及病理分级有关，值得进一步研究。但本研究对于相关生物学因子的多元线性回归的研究不足，存在一定的局限。

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