埃兹蛋白通过L1细胞黏附分子信号通路促进肺癌转移*

冯 辉，金明根，金铁峰

(1.延边大学附属医院重症医学科，吉林延吉 133000；2.延边大学肿瘤研究中心，吉林延吉 133002)

在我国，肺癌的发病率及病死率居于各类恶性肿瘤的首位[1-2]。本课题组前期研究结果发现，埃兹蛋白(Ezrin)在非小细胞肺癌组织中明显高表达，且与肿瘤的恶性程度及不良预后呈正相关[3-5]。L1细胞黏附分子(L1-cell adhesion molecule,L1CAM)可以使细胞间黏附性丧失，现已证实其与肿瘤发生转移密切相关[6-8]。最新的研究证实Ezrin可与L1CAM紧密结合行使重要功能[9]，但其具体机制不详。本研究旨在探讨Ezrin通过调控L1CAM的表达促进肺癌发生转移的机制，为临床诊治肺癌提供新的理论基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 肺癌细胞系人肺大细胞癌细胞H460、人肺鳞癌细胞EBC-1、人肺腺癌细胞A549、人肺腺癌细胞PC9、人肺腺癌细胞H1299、人肺巨细胞癌细胞95D等(美国ATCC公司)；RPMI 1640培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶(美国Santa Cruz 公司)；鼠抗人Ezrin及L1CAM抗体(美国Abcam公司)；电化学发光(ECL)试剂盒(美国Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养 试验选取肺癌细胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D等细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，3 ℃、5%CO2常规培养、传代。

1.2.2RT-PCR检测肺癌细胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 细胞Ezrin的表达 用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞，以Triozol充分裂解细胞后，加入氯仿震荡，加入异丙醇静置，反应温度为95 ℃变性，58 ℃退火，72 ℃延伸。行凝胶电泳，最终置于凝胶成像仪分析结果，分析各细胞系Ezrin的表达水平。Ezrin引物序列：上游5′-TGGAGTTGATGCCCTTGGAC-3′;下游 5′-AGTCAGGTGCCTTCTTGTC-3′。

1.2.3Westem blot检测 通过Western blot 检测肺癌细胞系H460、EBC-1、A549、PC9、H1299、95D 细胞Ezrin蛋白的表达，将上述细胞系以冷PBS洗2次后提取总蛋白，二喹啉甲酸法(BCA)测定蛋白浓度，8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳垂直电泳进行蛋白分离，转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室温下摇床封闭[Tris缓冲生理盐水吐温(TBST)+5%脱脂奶粉]2 h，加入一抗，4 ℃过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶二抗，孵育2 h。ECL曝光，观察并拍照。试验重复3次。

1.2.4应用siRNA沉默高转移肺癌95D细胞系Ezrin的表达 应用Ezrin小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA，由广州锐博公司构建)沉默肺癌高转移细胞系95D的Ezrin的表达。Ezrin siRNA-1正义链：5′-AAGGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反义链：3′-dTdTUUCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。Ezrin siRNA-2正义链：5′-GGAAUCCUUAGCGAUGAGAdTdT-3′,反义链：3′-dTdTCCUUAGGAAUCGCUACUCU-5′。选取Ezrin沉默效率更高的Ezrin siRNA-1进行后续试验。通过Western blot检测沉默有效性。

1.2.5划痕试验 应用划痕实验对比肺癌高转移细胞系95D细胞和Ezrin沉默后95D细胞(siEzrin-95D)的迁移能力 将5×105个细胞(95D细胞和siEzrin-95D细胞)接种于10 cm培养皿中，待细胞融合度达到80%，用移液枪枪头在单层细胞上划一条直线，用PBS清洗3次。培养48 h后观察周边细胞生长程度并拍照，进行比较分析。

1.2.6L1CAM蛋白表达检测 检测Ezrin基因沉默前后高转移肺癌细胞95D和低转移肺癌细胞H460的L1CAM蛋白表达。同样应用小干扰RNA沉默95D和 H460细胞的Ezrin的表达，进一步通过Western blot检测95D、siEzrin-95D、H460、siEzrin-H460细胞的L1CAM蛋白表达情况。

2 结 果

2.1Ezrin促进肺癌细胞迁移 RT-PCR及Western blot结果显示在高转移肺癌细胞系95D及PC9中Ezrin 表达均明显高于低转移肺癌细胞系H460及EBC-1(图1)。应用siRNA沉默95D细胞Ezrin基因表达，通过Western blot验证Ezrin基因沉默有效性(图2A)后，进一步通过细胞划痕试验发现，与95D细胞相比,siEzrin-95D细胞的迁移能力明显减弱(P<0.05)，见图2B、C。

A:RT-PCR检测各组细胞系中Ezrin的表达；B：Western blot检测各组细胞系中Ezrin的表达。

图1细胞系中Ezrin的表达

A:Western blot检测95D细胞及siEzrin-95D细胞中Ezrin的表达；B：划痕试验 95D细胞及siEzrin-95D细胞经处理48 h后细胞迁移情况；C：划痕试验结果定量分析

图2 Ezrin沉默对95D细胞迁移能力的影响

A．Western blot检测Ezrin基因沉默前后95D细胞和H460细胞L1CAM的表达；B.L1CAM蛋白的定量分析

图3 siRNA沉默95D细胞和H460细胞Ezrin

后细胞中L1CAM蛋白比较

2.2Ezrin 通过L1CAM信号通路调控肺癌细胞的迁移能力 前面试验已经证实，沉默95D细胞Ezrin表达后，其细胞迁移能力明显下降。进一步研究发现siRNA沉默95D及H460细胞Ezrin表达后，与95D及H460细胞比较，siEzrin-95D及siEzrin-H460细胞中L1CAM的表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3 讨 论

研究发现，Ezrin在肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，在有淋巴及远隔转移的非小细胞肺癌中阳性表达率显著高于无淋巴转移者，且与肺癌远处转移呈正相关[10]。Ezrin可以通过EGFR信号通路调控非小细胞肺癌的演进[11]。L1CAM在肿瘤的转移过程中起重要作用[12-13]。通过生物信息学网站检索发现Ezrin与L1CAM具有密切的相关性，提示Ezrin基因可能通过调控L1CAM的表达而促进肺癌发生远处转移，但其具体调控机制目前鲜见报道，还有待于深入研究。KUDUMALA等[9]的研究证实Ezrin可以特异地与L1CAM结合，在黑腹果蝇的神经传导过程中起重要作用。AIKAWA[14]研究表明，L1CAM在靠近细胞膜表面的部位存在Ezrin泛素化结合域，并对其基因表达、转录调节、信号传递等一系列生命活动起到重要影响。KIEFEL等[15]在肺癌细胞系的研究中发现，Ezrin结合到L1CAM蛋白后可以介导并活化核因子kappa B(NF-κB)信号通路，从而促进表皮间质化(MET)的发生。

本研究结果显示，Ezrin在高转移能力肺癌细胞系中的表达显著高于低转移能力的肺癌细胞系。通过siRNA沉默抑制肺癌细胞Ezrin的表达后肺癌细胞迁移能力明显下调，且Ezrin表达水平下调后L1CAM的表达显著受到抑制。这提示，Ezrin的表达与肺癌细胞的迁移能力具有密切相关性，其机制可能是通过调控L1CAM信号通路而实现的。Ezrin及L1CAM分子有可能成为控制肺癌发生远处转移的重要靶点，该研究结果为临床诊治肺癌，尤其是预防肺癌发生转移提供了重要的研究线索。

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