结直肠癌HER2及Ki-67表达的关系及预后因素分析*

孙旭凌，申 婧，黄桂林，李豫江，李志刚△

(石河子大学医学院第一附属医院：1.普外二科;2.神经内科，新疆石河子 832008)

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。从2000年到2011年，我国结直肠癌发病率及年龄标准化发病率显著上升[1]。人表皮生长因子受体 2(HER2)是人类原癌基因之一，对结直肠癌细胞生长和生存有着重要的调节作用。细胞增殖核抗原(Ki-67)是具有代表性的增殖抗原之一，与肿瘤的增殖、转移相关。本研究通过比较结直肠癌患者中HER2和Ki-67的表达情况，观察其与临床病理特征的关系，探讨二者的相关性及对预后的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2010年1-12月本院结直肠癌患者石蜡病理标本71例。所有患者术前均未经过化疗，其中有5例术前肝转移，1例肺转移。患者中男33例，女38例；年龄34～79岁，中位年龄62岁；右半结肠癌11例，横结肠2例，左半结肠癌18例，直肠癌39例，多发癌(降结肠+低位直肠癌)1例；高分化5例，中分化56例，低分化10例；T1期3例，T2期23例，T3期22例，T4期23例；无淋巴结转移47例，淋巴结转移24例(12例N1，12例N2)；Ⅰ期19例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例。同时选择30例距肿瘤大于5 cm的癌旁正常组织作为对照。

1.2方法

1.2.1试剂与方法 兔抗人HER2单克隆抗体和鼠抗人Ki-67单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物科技有限公司。采用免疫组织化学SP法，标本切片，脱蜡、水化，经0.3%H2O2消化内源性过氧化物酶后，再高压抗原修复，一抗、二抗、三抗作用后，用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封片，镜下观察。

1.2.2结果判定 由两名高级职称医师进行读片。Ki-67以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，HER2阳性表达以细胞膜出现棕黄色颗粒为准。(1)HER2参照美国临床肿瘤协会提出的HER2检测指南[2]。(-)：肿瘤细胞没有染色或少于10%细胞膜染色；(+)： >10%细胞有不完整的胞膜染色；(2+)：>10%细胞有完整的但较弱的胞膜染色；(3+)：>30%细胞有完整的较强的胞膜染色。(2)Ki-67按阳性细胞所占比例数分类如下。(-)： ≤10%， (+)：11%～24%，(2+)：>24%～50%，(3+)：>50%。上述结果(-)归为阴性表达组，(+)、(2+)、(3+)归为阳性表达组。本研究71例结直肠癌组织中Ki-67阳性表达率高，从5%到95%，不服从正态分布，中位数75%，以此将Ki-67分为高表达、低表达组。

1.2.3随访 术后采用电话及入户方式进行随访，起点为手术日，终点为患者出现死亡、失访或至截止时间(2015年12月30日)，随访结束时，获得完整随访资料69例，随访率为97.1%。18例患者死亡，其中15例死于癌转移，2例死于心梗，1例死于肝硬化。术前肝转移的4例患者中3例死亡，1例带瘤生存。术后出现转移的患者有9例，其中5例肝转移，3例肺转移，1例骨转移。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理，计数资料的比较用χ2检验，相关性采用Spearman相关性分析，生存分析采用Kaplan-Meier和Longrank检验，多因素分析采用Cox比例风险模型，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1HER2、Ki-67在结直肠癌组织和癌旁组织的表达 HER2结直肠癌组织阳性表达率为32.4%(23/71)，高于癌旁组织的10.0%(3/30)，差异有统计学意义(χ2=5.533，P=0.019)。Ki-67在结直肠癌组织阳性表达率为85.9%(61/71)，高于癌旁组织的6.7% (2/30)，两者比较差异有统计学意义(χ2=56.437，P=0.001)，见图1、2。

图1 HER2在结直肠癌组织的阳性表达(×400)

2.2HER2、Ki-67的表达与结直肠癌临床病理特征的关系及两者相关性 71例结直肠癌组织中，HER2阳性表达与分化程度、有无淋巴结转移、淋巴结转移数目、TNM分期有关(P<0.05)，而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度无关(P>0.05)。Ki-67表达与肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移、淋巴结转移数目、TNM分期有关(P<0.05)，而与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度无关(P>0.05)，见表1。HER2、Ki-67在结直肠癌组织中表达呈正相关(r=0.515，P=0.001)。

图2 Ki-67在结直肠癌组织的阳性表达(×400)

2.3HER2、Ki-67的表达水平与结直肠癌患者术后5年无病生存率、5年生存率的关系 HER2阳性患者和阴性患者术后5年无病生存率分别为48.4%、80.8%，差异有统计学意义(χ2=7.932，P<0.05)；Ki-67高表达患者和低表达患者术后5年无病生存率分别为56.5%、85.5%，差异有统计学意义(χ2=5.747，P<0.05)。

HER2阳性患者和阴性患者术后5年生存率分别为60.9%、80.8%，差异有统计学意义(χ2=4.762，P<0.05)；Ki-67高表达患者和低表达患者术后5年生存率分别为63.9%、85.5%，差异有统计学意义(χ2=4.020，P<0.05)。

单因素分析显示，肿瘤分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、转移淋巴结数目、TNM分期、HER2和 Ki-67表达情况与患者的预后均有关(P<0.05)，见表2、图3～6。

表1 HER2、 Ki-67的表达与结直肠癌临床病理特征的关系(n)

图4 HER2阳性患者5年生存曲线

图5 Ki-67阳性患者5年无病生存曲线表2 结直肠癌患者预后影响因素的单因素分析结果

临床病理特征n生存率(%)χ2P性别0.1650.684 男3372.1 女3876.3年龄(岁)1.9310.165 <603065.6

2.4Cox模型分析影响结直肠癌患者预后的因素 Cox 多因素分析结果显示，TNM分期、浸润深度为影响患者预后的独立因素，见表3。

表3 结直肠癌患者预后影响因素的Cox多因素回归分析结果

图6 Ki-67阳性患者5年生存曲线

3 讨 论

HER2是癌基因erbB2的编码产物，相对分子质量约为185 KU，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，属于表皮生长因子受体家族的成员，HER2在肠癌中的临床意义尚存在争议。本研究结果显示，HER2结直肠癌组织阳性表达率为32.4%(23/71)，高于癌旁组织的10.0%(3/30)，差异有统计学意义。本研究的阳性率低于张凯等[3]研究报道的62.5%(35/56)，而高于吕洋等[4]、KOUNTOURAKIS等[5]研究报道的阳性率(不到5%)。之所以报道的比例有差异，可能原因如下：(1)有的学者把HER2膜表达蛋白标准加上了细胞质阳性表达后导致比例过高；(2)由于样本量的不同及结果判定标准和方法的差异所造成的。本研究显示HER2阳性表达与分化程度、有无淋巴结转移、淋巴结转移数目、TNM有关，HER2阳性组5年无病生存率、5年生存率均低于阴性组，与王琼等[6]研究结果相似，该研究报道HER2阳性淋巴结转移者的表达率明显高于无淋巴结转移者。邓巍等[7]研究发现结直肠癌HER2过表达与肿瘤细胞的分化程度及病理分期密切相关，HER2过表达患者的10年生存率明显降低。分析本课题结果，HER2过表达的结直肠癌侵袭力增强、生存率降低的原因，可能与HER2能通过启动多种转移相关机制而增加转移能力有关，包括细胞迁移率、体外侵袭力、Ⅳ型胶原酶活性，影响黏附分子如上皮细胞钙黏蛋白合成等,进而刺激癌细胞增长，侵袭性增加，复发和转移相对较快[8-9]。

Ki-67是具有代表性、应用广泛的增殖抗原之一，在细胞周期各期中，其表达受到高度准确的调控，与肿瘤的增殖、转移呈正相关[10]。OKIMURA等[11]研究发现Ki-67与细胞黏附分子CD44s、CD44v6等在胰腺乳突黏液腺癌及相关浸润性癌中的表达具有相关性。本课题结果显示Ki-67在结直肠癌组织阳性表达率为85.9%(61/71)，高于癌旁组织的6.7%(2/30)，71例结直肠癌组织中Ki-67阳性表达率极高，从5.0%到95.0%，且不服从正态分布，中位数75.0%，以此将Ki-67分为高表达、低表达组，其表达与肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移、淋巴结转移数目、TNM分期有关.这与刘萍等[12]、马海龙等[13]研究结果类似，证实淋巴结转移数量越多、浸润程度越深，Ki-67的阳性率越高。张晓雨等[14]研究显示Ki-67阳性表达率为90.9%，Ki-67平均值为(37.47±25.14)%，以此为界，分为高表达组和低表达组，高表达组生存率低于低表达组，支持此观点的还有史汉蒙等[15]学者，此结果和本研究一致。在本研究中，Ki-67高表达组和低表达组术后5年生存率分别为63.9%、85.5%，差异有统计学意义。本研究证实HER2与Ki-67呈正相关，共同促进肿瘤生长，究其原因，与两者的作用机制密不可分，当HER2蛋白过表达时，HER2异源二聚体形成数目增加，导致细胞内酪氨酸激酶蛋白活化，发生酪氨酸自身磷酸化，激活多种信号传导途径，如磷脂酶C(PLC)、Ras/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，引发瀑布式连锁反应，信号传导经细胞膜、细胞间质至细胞核，进而激活基因、促进Ki-67的活化，导致细胞的增殖，调控细胞周期引起肿瘤的迅速生长。目前HER2和Ki-67在乳腺癌有重要作用，Ki-67的14.0%值是乳腺癌基因分型的重要临界值[16]，针对HER2的生物靶向治疗已成为个体化治疗的首选方案。而现在对于HER2在结直肠癌中的重要性也逐步得到专家认为，有报道显示结直肠癌HER2也与抗EGFR治疗的耐药相关，约5%的K-ras野生型晚期结直肠癌患者中HER2高表达，这些患者均对西妥昔单抗原发耐药，给这些患者拉帕替尼联合曲妥珠单抗的双重HER2抑制治疗，有效率达34.7%[17]。这也为今后的结直肠癌的临床工作提供新的思路，可以把HER2和Ki-67作用评估及治疗结直肠癌的重要靶点。

本课题在进行Cox多因素分析分析时发现，HER2和Ki-67并不是结直肠癌的独立危险因素，原因可能是两者的阳性判定标准目前尚无统一，这还需进一步研究及验证。

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