冠状动脉严重狭窄患者血浆miRNA⁃195表达及其与侧支循环形成的关系

郑颖 李强 阳慧 林德洪 邢波

中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院心内科（海口 570208）

冠状动脉侧支循环（coronary collateral circula⁃tion，CCC）形成是心肌缺血缺氧后建立起来的代偿机制，有助于缓解临床症状，提高生存质量［1］。目前认为，侧支循环的形成受冠状动脉狭窄程度的影响［2］，但是其中的分子机制尚不明确。miR⁃NAs作为高度保守的非编码小RNA，参与了众多生物过程的调控［3］。miRNA⁃195是 microRNA⁃15/16/195/424/497 家族中的一员［4］，有研究［5］表明，miRNA⁃195参与了多种心血管疾病的进展过程。为此，本研究试图探讨冠状动脉严重狭窄患者血浆miRNA⁃195的表达及其与侧支循环形成的关系，目的在于发现对于冠状动脉侧支循环形成有价值的生物标记物。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 病案选取 入选病例为2016年3月-2017年5月期间我院血管内科住院并接受选择性冠状动脉造影（Coronary angiography，CAG）检查的患者，共190例。纳入标准：（1）符合2014年美国心脏病学院（American College of Cardiology，ACC）和美国心脏协会（American Heart Association，AHA）修订版诊疗指南中的诊断标准［6］；（2）CAG提示左前降支、左回旋支和右冠状动脉3支中至少1支狭窄程度≥90%。排除标准：（1）既往有冠状动脉旁路移植（Coronary artery bypass grafting，CABG）手术史；（2）既往有经皮冠状动脉介入（Percutaneous coro⁃nary intervention，PCI）治疗史；（3）冠状动脉畸形；（4）伴有冠状动脉心肌桥；（5）伴有瓣膜性心脏病；（6）急性心肌梗死；（7）急诊CAG 或PCI；（8）伴有严重感染、肿瘤、肝肾功能不全等。本研究经所有入选者及家属知情签字，医院伦理委员会通过。

1.2 方法

1.2.1 冠状动脉造影以及冠状动脉病变程度的评估 选择桡动脉或股动脉穿刺行CAG检查。仪器为Philips HC500型心血管专用X线机，视野为7英寸，12.5f/s采集。图像以512×512矩阵、DICOM格式储存、刻盘。

冠状动脉病变程度的评估采用Gensini积分法［7］。按照AHA制定的冠状动脉血管图像记录分段评估标准评定所有分支血管的病变程度，狭窄程度≤25%为1分，25%～49%之间为2分，50%～74%之间为4分，75%～89%之间为8分，90%～99%之间为16分，100%为32分。不同节段冠状动脉病变程度分别为各自评分乘以相应系数，具体为：左冠状动脉主干病变程度＝得分X5，左前降支近段病变程度＝得分X 2.5，左前降支中段病变程度＝得分X 1.5，左前降支远段病变程度＝得分X1，对角支（D1）病变程度＝得分X1，对角支（D1）病变程度＝得分X0.5，左回旋支近段病变程度＝得分X 2.5，左回旋支远端病变程度＝得分X1，后降支病变程度＝得分X1，后侧支病变程度＝得分X 0.5，右冠病状动脉近段、中段、远段和后降支病变程度（均）＝得分X1。最终积分为所有病变分支积分之和。

1.2.2 冠状动脉侧支循环的分级 采用Rentrop法［8］对冠状动脉侧支循环进行分级，具体为：（1）0级：无任何侧支循环被造影剂充盈；（2）1级：造影剂充盈侧支循环病变血管的分支，但没有到达心外膜下血管段；（3）2级：造影剂充盈部分心外膜下血管段；（4）3级：造影剂充盈整个心外膜下血管段。其中，0、1级视为侧支循环不良，2、3级视为侧支循环良好。

1.2.3 血浆miRNA⁃195的检测 所有入选患者者在入院后第2天清晨于空腹状态下采肘静脉血5 mL，对照组在体检当天上午空腹状态下采肘静脉血5 mL，置于EDTA抗凝试管中，室温下静置20 min，3 000 r/min离心15 min，分离血浆置于1.5 mL EP管中，-20℃保存。

采用Trizol溶液（美国Invitrogen生产）提取总RNA。步骤如下：（1）冰上融化冷冻血浆；（2）取250 μL血浆和1 mL Trizol置入无Rnase的EP管中，涡旋混匀，室温下静置5 min；（3）加入0.2 mL氯仿，振荡15 s后，室温下静置5 min；（4）4 ℃，12 000 r/m离心10 min，取0.5 mL上层水相，置入另外的无Rnase的 EP管中；（5）加入0.5 mL异丙醇，涡旋混匀，室温下静置5 min；（6）4℃，12 000 r/min离心10 min，去上清，RNA沉淀于离心管管底；（7）加入75%乙醇1 mL，洗涤RNA沉淀，4℃，12 000 r/min离心2 min，去上清；（8）4℃，12 000 r/min离心1 min，去上清；（9）晾干，置于空气中 5～10 min，干燥RNA 沉淀；（10）加入 10～20 μL DEPC H2O 溶解RNA沉淀。

PCR扩增。引物由生工生物工程有限公司生产，miRNA⁃195 的上游引物5′⁃UAGCAGCACAGA⁃AAUAUUGGC⁃3′，下游引物 5′⁃CAAUAUUUCU⁃GUGCUGCUAUU⁃3′；引物序列正义链5′⁃ACCATG⁃GATGATGATATCGCC⁃3′，反义链 5′⁃GCCTTGCA⁃CATGCCGG⁃3′；反应条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60℃ 1 min，50个循环。

测序与分析。将miRNA逆转录为cDNA，采用荧光定量的方法检测（荧光定量检测试剂盒由北京全式金生物技术有限公司生产），miRNA⁃195的表达量 =2-ΔCT，ΔCT=CT（miRNA⁃195）－CT（内参引物）（内参引物为18sRNA引物，由生工生物工程有限公司生产）。

1.2.4 血浆血管内皮生长因子（vascular endothe⁃lial growth factor，VEGF）的检测 所有入选患者者在入院后第2天清晨于空腹状态下采肘静脉血5 mL，对照组在体检当天上午空腹状态下采肘静脉血5 mL，EDTA抗凝，室温下静置20 min，2 000 r/min离心10 min，分离血浆转入EP管中，-20℃保存。采用ELISA法检测血浆VEGF水平（试剂盒由美国R&D公司生产并提供）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0进行分析处理。计量资料的正态检验采用One⁃Sample Kolmogorov⁃Smirnov Test法，正态分布的计量数据用±s表示，两组间数据比较采用t检验；计数资料采用率或百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性检验采用Persona分析；取P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 比较侧支循环不良组与侧支循环良好组的基线指标 Rentrop法分级显示，入选患者中侧支循环不良者90例，侧支循环良好者100例。经过比较发现，除了侧支循环良好组的Gensini积分明显高于侧支循环不良组，差异具有统计学意义（P＜0.05），其他所有基线指标差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 侧支循环不良组与侧支循环良好组基线指标的比较Tab.1 Comparison of baseline indicators between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

表1 侧支循环不良组与侧支循环良好组基线指标的比较Tab.1 Comparison of baseline indicators between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

注：性别★、糖尿病★、高血压★、吸烟史★、服用ACEI/ARB类药物★、服药β-受体阻滞剂★、服用他汀类药物★采用χ2检验，其余基线指标采用t检验

基线指标性别★男［例（%）］女［例（%）］年龄（岁）病程（年）糖尿病［例（%）］★高血压［例（%）］★吸烟史［例（%）］★服用ACEI/ARB类药物［例（%）］★服药β-受体阻滞剂［例（%）］★服用他汀类药物［例（%）］★TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL⁃C（mmol/L）LDL⁃C（mmol/L）Gensini积分侧支循环不良组（n=90） 侧支循环良好组（n=100）t（χ 2）值0.217 P值0.642 51（56.67）39（43.33）61.45±7.33 5.13±0.62 26（28.89）39（43.33）18（20.00）51（56.67）59（65.56）80（88.89）1.75±0.22 5.19±0.67 0.95±0.05 3.70±0.45 67.51±8.55 60（60.00）40（40.00）61.89±8.13 5.30±0.71 42（42.00）51（51.00）25（25.00）63（63.00）73（73.00）95（95.00）1.79±0.25 5.25±0.72 0.96±0.06 3.75±0.51 118.35±14.56 0.390 1.749 2.580 1.117 0.676 0.792 1.238 2.433 1.165 0.593 1.240 0.713 29.690 0.697 0.082 0.108 0.291 0.411 0.374 0.266 0.119 0.245 0.554 0.216 0.477 0.000

2.2 比较侧支循环不良组与侧支循环良好组的血浆miRNA⁃195和VEGF水平 结果显示，侧支循环良好组的血浆miRNA⁃195和VEGF水平均明显高于侧支循环不良组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 侧支循环不良组与侧支循环良好组血浆miRNA⁃195和VEGF水平的比较Tab.2 Comparison of plasma miRNA⁃195 and VEGF levels between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

表2 侧支循环不良组与侧支循环良好组血浆miRNA⁃195和VEGF水平的比较Tab.2 Comparison of plasma miRNA⁃195 and VEGF levels between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

组别侧支循环不良组侧支循环良好组t值P值例数90 100血浆miRNA⁃195（2－ΔCT）4.45±0.40 7.62±0.85 33.410 0.000血浆VEGF（ng/L）215.25±25.62 364.08±38.52 31.637 0.000

2.3 所有入选患者血浆miRNA⁃195与VEGF水平的相关性分析 Person相关分析显示，冠心病患者血浆miRNA⁃195与VEGF水平呈正相关性（r=0.628，P=0.022）。

2.4 所有入选患者血浆miRNA⁃195与Gensini积分的相关性分析 Person相关分析显示，冠心病患者血浆miRNA⁃195与Gensini积分呈正相关性（r=0.765，P=0.013）。

3 讨论

侧支循环能够代偿地供血的不足，保护左室功能、缩小梗死面积，减少各种心脏不良事件的发生率，是缺血性心脏病的重要保护机制［1］。目前，由于侧支循环需要经过CAG这样的有创检查才能够被证实，因此寻找一种可以预测侧支循环形成的生物标记物具有一定的临床意义。

研究显示［9］，miRNAs在病理过程中的变化较其他生物标记物要早，并且血浆中的miRNAs大多与蛋白结合或被脂质包膜包裹，稳定性高，不容易被RNA酶降解，因此将血浆中的miRNA作为疾病检测的生物学标记物具有可操作性。研究已证实［10］，miRNA⁃195在心血管疾病的进程中起着重要作用，在急慢性缺血性心脏病的心肌肥厚、心肌纤维化的过程中均发现有miRNA⁃195的参与，在主要的心血管细胞中（内皮细胞、平滑肌细胞）均发现miRNA⁃195的高表达，甚至是心血管疾病进程中的差异性表达。本研究就发现，在冠状动脉严重狭窄的患者中，侧支循环良好组的血浆miR⁃NA⁃195明显高于侧支循环不良组，与有关文献的结果吻合。

VEGF在新生血管的生成过程中具有重要作用，侧支循环的血管生成大约需要10 ～ 14 d［1］，动物实验的结果显示，大鼠急性心梗模型术后14 d VEGF动态水平达到峰值［11］，犬心肌缺血模型术后21 d的VEGF呈现持续上升趋势［12］。有学者指出［13］，可能是miRNA以调控VEGF的方式诱发了侧支循环的形成，但并未肯定是miRNA⁃195。有文献表明［14］，血浆VEGF水平与侧支循环的形成情况呈正相关性，即血浆VEGF水平越高则侧支循环越良好。本研究显示，侧支循环良好组的血浆VEGF水平均高于侧支循环不良组，与文献结论一致。

本研究经过Person相关分析发现，冠心病患者血浆miRNA⁃195与VEGF水平呈正相关性。MA等［15］发现，miRNAs作为缺氧性诱导基因，在其表达上调后能够引发白细胞的增加和NF⁃kB表达的上调，促使IL⁃6、IL⁃8等炎性因子的释放，从而加强机体的炎性反应，在持续炎症反应的作用下，VEGF释放增加促发了新生血管的生成。虽然目前并未见文献显示miRNA⁃195直接参与了VEGF表达的上调，但是可以推测血浆miRNA⁃195与VEGF水平具有比较密切的关系。

本研究最后的数据分析显示，冠心病患者血浆miRNA⁃195与Gensini积分呈正相关性。目前临床上普遍认为［16］，冠状动脉的狭窄程度是侧支循环形成的主要影响因素，狭窄程度越严重则对侧支循环形成的影响越大，当狭窄程度超过冠状动脉的90%时候，其影响程度达到最大。因此可以认为，冠状动脉严重狭窄后，在机体缺血缺氧等因素的作用下诱发了miRNA⁃195表达的上调。

综上所述，冠状动脉严重狭窄患者侧支循环的形成过程中，miRNA⁃195可能是通过调控VEGF诱导着新生血管生成的相关通路发挥着重要作用，因此可以尝试将其作为预测侧支循环形成的生物标记物供临床参考。

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