超高效液相色谱-串联四级杆质谱法测定火锅底料中5种生物碱的方法改进

包永华，王璐璐，刘帆

(1.浙江经贸职业技术学院 应用工程系，杭州 310018；2.浙江方圆检测集团股份有限公司，杭州 310013)

火锅，古称“古董羹”，是一种颇受我国人们欢迎的美食。但近年来，火锅却频频被曝出一些安全问题[1]，少数不法经营者为了牟取暴利，在火锅底料中违法添加罂粟壳(籽)或其粉碎物、浸提物[2]，诱骗食用者中毒成瘾, 危害消费者健康。针对此种行为国家已多次明令禁止，但由于现行业内缺乏快速有效、针对性强的检测方法，使得食品安全执法工作存在一定难度。

罂粟壳，俗称“米壳”，为植物罂粟的干燥成熟果壳[3]，含有20多种生物碱，其中以吗啡、可待因、罂粟碱、蒂巴因、那可丁等为主要成分[4]。这些生物碱的副作用亦不可低估[5]，长期食用无论从身体上还是心理上都会对其产生严重的依赖性，造成毒物癖，对自身和社会都造成了很大的危害。

目前，罂粟壳中生物碱的测定方法主要有分光光度法[6]、层析法[7]、示波极谱法[8]、气相色谱法[9]、液相色谱法[10]、液质联用法[11]和气质联用法[12]。但由于火锅底料中香料物质众多，给微量生物碱的检出造成了严重干扰[13]。因此有必要建立一种预处理方法简便、检测灵敏、定量准确且快速的方法来测定食品中罂粟壳残留物的含量。本研究以上海市食品安全地方标准(DB 31/2010-2012)[14]《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法》中的实验方法为基础，着重对生物碱的提取、样品预处理过程进行优化，确保在能达到低检出限要求的同时，控制回收率在90%～110%以内，RSD均小于10%。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：火锅底料，购于杭州世纪联华超市。

试剂：罂粟碱(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司，浓度10 mg/L；那可丁(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司，浓度10 mg/L；蒂巴因(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司，浓度10 mg/L；吗啡(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司，浓度50 mg/L；可待因(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司，浓度50 mg/L；可待因(D3内标)(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司, 浓度20 mg/L；吗啡(D3内标)(纯度97.5%)，CDGG-G34-142340-01-1 mL，上海安谱，o2si公司, 浓度20 mg/L；乙腈，德国Merck公司，型号1.00030.4008，含量99.9%，规格4 L；C18，上海安谱实验科技股份有限公司，100 g/瓶；PSA，上海安谱实验科技股份有限公司，100 g/瓶；超纯水仪，美国Millipore公司；滤膜，北京迪马科技有限公司，13 mm，0.22 μm，100/pk。

1.2 仪器与设备

1290 Infinity高效液相色谱仪 Agilent Technologies公司；QTRAP 5500 串联四极杆质谱仪 AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈+0.1%甲酸水(梯度洗脱)；流速：0.3 mL/min；柱温: 30 ℃；进样量: 5 μL。

1.3.2 质谱条件

离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：MRM；雾化气GS1：65.0 psi；辅助加热气GS2：65.0 psi；气帘气CUR：35.0 psi；辅助气温度TEM：500 ℃；喷雾电压IS：4800 V；入口电压EP：10.0 V；碰撞池电压CXP：12.0 V；碰撞气CAD：Medium。5种生物碱质谱条件参数见表1。

表1 5种生物碱质谱参数Table 1 MS parameters of five alkaloids

注：“*”为定量离子。

1.3.3 标准溶液的配制

将罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因配制成浓度为10 mg/L以及1 mg/L的标样待用。

1.3.4 样品预处理

取样品5 g，加入5 μL，浓度为20 mg/L的内标，加入10 mL乙腈，充分涡旋后振荡10 min，12000 r/min离心5 min后提取上清液，分别加入适量C18和PSA吸附净化粉末，充分涡旋后静置约3 min，取适量上清液过0.22 μm滤膜，上机待测即可。

2 结果与分析

2.1 标样质谱图

根据DB 31/2010-2012标准中的要求，那可丁、罂粟碱、蒂巴因定量限为25 μg/kg，可待因和吗啡定量限为125 μg/kg。因此按照改进步骤中的稀释倍数，将 1.3.3 中配制好的标准溶液再次稀释后分别适量加入空白样的火锅底料中，使得那可丁、罂粟碱、蒂巴因标样上机浓度为5 μg/L，可待因和吗啡上机浓度为25 μg/L。经过改进的实验方法处理后，进样分析。

图1 那可丁出峰质谱图Fig.1 The mass-spectrogram of narcotine

图2 罂粟碱出峰质谱图Fig.2 The mass-spectrogram of papaverine

图3 蒂巴因出峰质谱图Fig.3 The mass-spectrogram of thebaine

图4 可待因出峰质谱图Fig.4 The mass-spectrogram of codeine

图5 吗啡出峰质谱图Fig.5 The mass-spectrogram of morphine

图6 内标物出峰质谱图Fig.6 The mass-spectrogram of internal standard

由图1～图6可知，那可丁出峰时间在3.36 min，峰高最大值9.3e5 cps；罂粟碱出峰时间在3.34 min，峰高最大值1.1e6 cps；蒂巴因出峰时间在3.30 min，峰高最大值6.7e5 cps；可待因出峰时间在0.95 min，峰高最大值2.5e5 cps；D3-可待因内标出峰时间在0.95 min，峰高最大值5.5e4 cps；吗啡出峰时间在0.95 min，峰高最大值1.2e5 cps；D3-吗啡内标出峰时间在0.94 min，峰高最大值2.4e4 cps。由此可见，火锅汤料中的基质对吗啡、罂粟碱等生物碱的检测并无干扰，出峰时间稳定，峰形较为明显。

2.2 回收率试验

取上述阴性样品，分别加入不同量的标准溶液，使得那可丁、罂粟碱、蒂巴因、可待因、吗啡理论上机浓度分别为5，10，15，20，25 μg/L，按照 1.3.4 样品预处理方法进行处理，上机进样分析后，结果见表 2。

表2 各目标物加标回收率Table 2 The recovery rates of five alkaloids

经过多次实验表明，该改良版实验步骤能够完全保证实验数据的有效可行性，回收率控制在90%～110%。

2.3 精密度试验

取浓度为 5 μg/L的基质标准溶液，重复进样3次，结果见表 3。

表3 检测方法精密度Table 3 Precision of inspection method

由表3可知，那可丁、罂粟碱、蒂巴因、可待因、吗啡3次相应的RSD值在0.19%～1.33%范围内，精密度良好。

2.4 实际样品测定

为验证方法的可靠性，从超市购买了某品牌火锅底料，根据改进后的方法进行测定，样品均未检出这5种生物碱目标物，结果令人满意。

3 结论

优化了样品预处理过程。针对火锅底料高油脂的特性，采用乙腈作为溶剂直接振荡离心提取，C18和PSA静置净化，可将吗啡、罂粟碱等生物碱测定出来，且经过多次实验证明，该优化方法能够达到标准要求的目标物检出限。

检测方法灵敏度高，操作简便，可靠，重现性好。采用超高效液相色谱-串联四级杆质谱法定量检测了火锅底料中罂粟碱、吗啡、那可丁、蒂巴因以及可待因5种生物碱成分的含量。罂粟碱、吗啡、那可丁、蒂巴因以及可待因的回收率控制在95%～105%以内，RSD为0.19%～1.33%，该方法可充分适用于火锅底料以及其他油脂含量较高食品中生物碱的测定。

参考文献：

[1]刘少伟,阮赞林.火锅底料暗藏猫腻——高汤“勾兑门”事件[J].质量与标准化,2017(2):39-40.

[2]饶德荣,章厚安,林昌祥,等.火锅底料中添加罂粟壳的检验方法探讨[J].中国卫生检验杂志,1992(6):373-374.

[3]高志莹,洪霞,刘琦,等.UPLC-MS/MS同时测定肉汤中5种罂粟壳生物碱[J].食品研究与开发,2017,38(10):118-123.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015 年版 (第一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:369-370.

[5]张虹,廖文娟,蔡增轩,等.液质联用法检测掺罂粟壳食物中生物碱的残留[J].食品与发酵工业,2005(12):93-97.

[6]张忠会,王惠达,杨威.罂粟壳生物碱的可见分光光度法测定[J].中成药,2002(7):51-52.

[7]马明善,李岩,尤杰玉.掺伪食品中罂粟壳的纸层色谱测定法[J].中国卫生检验杂志,1992(6):375.

[8]陶锐,高舸,杨元.火锅汤料中吗啡的示波极谱测定[J].中国卫生检验杂志,1994(3):140-143.

[9]杜黎明,许庆琴,吴秀兰.大口径毛细管气相色谱法测定罂粟壳中的生物碱[J].色谱,1999(6):578-579.

[10]董南,王海燕.高效液相色谱法检测食品中多种香料共存时的罂粟壳[J].色谱,2000(6):554-555.

[11]王柯,郑荣,简龙海,等.火锅调料中5种生物碱成分的液相色谱-串联质谱测定法[J].中国卫生检验杂志,2011,21(2):363-365.

[12]沈平,谢朝梅,谢燕湘.气相色谱-质谱法测定食品中罂粟壳提取物的残留量[J].理化检验(化学分册),2016,52(1):48-51.

[13]张林田,史佳虹,杨晞,等.火锅底料及小吃类食品中非法添加罂粟壳的危害及检测技术研究进展[J].福建分析测试,2014(3):9-13.

[14]DB 31/2010-2012,火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因和蒂巴因的测定 液相色谱-串联质谱法[S].