裸藻遗传转化技术的研究进展

邵 青 蒋永光 雷安平 胡章立 王江新

(1. 深圳大学生命与海洋科学学院， 深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室， 深圳 518060；2. 中国地质大学(武汉)环境学院生物科学与技术系， 武汉 430074)

裸藻(Euglena)是单细胞的真核藻类， 没有细胞壁， 外侧由原生质膜包裹， 顶端生有鞭毛， 可以自由游动。裸藻细胞具有完整叶绿体， 在光下能够通过光合作用进行自养生长， 在无光照的条件下也可以利用外界有机物进行异养生长[1]。由于细胞具有感光的眼点结构， 在原生动物学研究中又称为“眼虫”；分子系统学的研究也表明， 裸藻与致病性寄生虫锥虫(Trypanosomes)和利士曼原虫(Leishmania)具有较近的亲缘关系[2]。因此， 裸藻具有植物和动物的双重特性。裸藻细胞核具有间核性质， 在细胞分裂过程中， 核膜和核仁均不消失， 染色体保持浓缩状态， 是一种介于真核和原核之间的类型。裸藻的叶绿体由两层叶绿体膜和一层内质网膜包围， 这种三层膜结构表明裸藻叶绿体起源于内共生的原始绿藻[3]。与其他具有叶绿体的藻类或高等植物不同，裸藻叶绿体稳定性较差， 在抗生素等胁迫条件下易丢失[4]。因此， 裸藻具有独特的细胞结构和生物学地位， 是研究真核生物进化和叶绿体内共生的良好材料， 具有重要的科研价值。

纤细裸藻(Euglena gracilis)是裸藻属中研究最多的一个模式种， 细胞呈椭球状或球状， 形态可变，长31—40 μm， 宽9—14 μm。纤细裸藻细胞富含多种维生素、氨基酸和多不饱和脂肪酸， 具有很高的营养价值[5]。2013年10月， 国家卫生和计划生育委员会发布公告， 批准裸藻等作为新食品原料。裸藻生长过程中能够积累大量的副淀粉(Paramylon)作为能量贮藏物质， 占到裸藻干重的50%—90%[6，7]。副淀粉是一种β-1，3-葡聚糖， 具有增强免疫力[8]、抗过敏[9]、抗病毒[10]和抗肿瘤[11，12]活性。在黑暗厌氧条件下， 裸藻细胞能够将副淀粉分解转化成蜡酯，而蜡酯具有广泛的工业用途， 并可以用来生产生物燃料[13，14]。因此， 纤细裸藻不但是一种高附加值的保健食品， 也是潜力巨大的生产生物能源的重要原料， 具有重要的经济价值。

目前， 裸藻的生物学研究主要集中在细胞生理、酶学特征、基因克隆等方面[15—19]， 对裸藻遗传转化的研究和应用极少， 制约了裸藻遗传学和裸藻生物技术的发展。文章结合作者所在课题组的研究工作， 以纤细裸藻为例， 对已有的裸藻遗传转化方法及其存在的问题进行了综述， 并对未来的研究进行了展望。

1 纤细裸藻的基因组序列及系统生物学信息

纤细裸藻含有细胞核、叶绿体、线粒体3套基因组。裸藻基因组巨大而且具有高度复杂的序列结构和高比例的重复序列， 测序拼接的难度极大[20]，经过3年多的努力本课题组已经率先完成纤细裸藻野生型藻株Z的基因组草图， N50 contig已达150 kb，并已初步确认纤细裸藻基因组约3.3 G， 此结果经过各种方法证实， 远大于模式生物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的124 M[21]、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的27.4 M[22]、团藻(Volvox carteri)的138 M[23]、小球藻(Chlorella variabilis)的46 M[24]； 其含有45%左右的重复序列， 给二代三代测序相结合的基因组组装造成了很大的困难， 该基因组草图的报告已经投稿； 另外， 通过本课题组获得的裸藻转录组和蛋白组， 发现不同寻常多的非编码RNA， 完成40128个基因的鉴定及功能注释； 其特殊复杂的间核结构、染色体组型以及基因组3D-STORM扫描、基因组的精细作图也正在进行。目前英国有实验室也正在组装该藻株的基因组， 他们的最新网站公开结果[EuglenaDB， https://sites.dunde-e.ac.uk/euglenadb/]表明裸藻的基因组大小(1.43 G)， N50为0.9 kb， 此结果与本课题组测序组装结果存在较大差异。每个裸藻细胞中含有约10个叶绿体[25]， 而每个叶绿体中含有200—600个基因组拷贝[26]， 叶绿体基因组与原核生物类似， 呈环状结构， 大小约143 kb， 编码87个已知的基因， 在基因内部至少含有149个内含子[27]。线粒体基因组为线性结构， 包含多个5—8 kb的线性片段， 编码7个呼吸链复合物蛋白， 包括3个复合物Ⅰ亚单位(分别由nad1、nad4、nad5编码)， 1个复合物Ⅲ亚单位(由cob编码)， 以及3个复合物Ⅳ亚单位(分别由cox1、cox2、cox3编码)； 另外， 线粒体内还含有一些小的未知功能的基因片段， 可能与DNA重组和RNA修饰有关[28]。

裸藻的de novo转录组在不同培养基培养下的初步研究已见报道[29，30]， 但其他组学数据包括蛋白组、小RNA组和甲基化组尚未见有报道。本课题组针对裸藻的叶绿体进化及细胞核-叶绿体的分子通信方面， 在不同的分子层面， 包括转录组、蛋白组、代谢组还有甲基化组进行了全面的数据收集，相关的文章在整理撰写当中； 与此同时， 在绿色裸藻里存在着黑暗处理条件下预光照1.5h可以消除从黑暗到光照下转换过程中长达12h的叶绿体分化延迟， 本课题组也在通过转录组试图探求其内在的调控机理； 而鉴于裸藻介于动植物的生物特性， 也在研究其microRNA全基因组信息， 及其microRNA在裸藻细胞光响应中的作用； 另外， 本课题组正在利用最新的单细胞分析技术， 同时解析4000—6000多个纤细裸藻在黑暗培养条件下添加甲基化酶抑制剂中约15%的细胞叶绿体分化的多态性问题。总之， 通过各种组学分析， 本课题组已经获得了一批跟叶绿体分化、叶绿体与细胞核分子通信相关的可能性关键基因和非编码小RNA， 也提出了几个新的假说理论， 急需一个高通量、高效的基因工程技术方法来进行功能验证。

2 纤细裸藻的抗生素耐受性和筛选标记

本课题组对纤细裸藻的抗生素耐受性进行了详细检测， 发现10 μg/mL以上的遗传霉素(G418)和博来霉素(Zeocin)就可以显著抑制裸藻细胞的生长，而巴龙霉素、潮霉素、卡那霉素、四环素以及除草剂(草铵膦)在30 μg/mL时对裸藻细胞仍没有明显抑制作用， 用更高浓度(＞ 100 μg/mL)的卡那霉素和巴龙霉素也可以显著抑制裸藻生长， 说明裸藻对多数抗生素和除草剂具有较强的耐受性， 但对G418和Zeocin较为敏感。

G418是一种氨基糖苷类抗生素， 其结构与巴龙霉素、卡那霉素相似， 通过干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对细菌和真核生物细胞都有毒性。在细胞转染中， 常用氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo)作为筛选标记， 该酶催化G418的磷酸化失活， 使细胞获得抗性。目前还没有用G418筛选裸藻的报道， 但已有文献使用了巴龙霉素进行裸藻突变株筛选， 并用新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)作为抗性标记[31]。

Zeocin是争光霉素家族的一种糖蛋白抗生素，能够降解细胞内的DNA， 对原核和真核细胞具有广泛的抑制作用。在莱茵衣藻的转化中， 采用来源于细菌Streptoalloteichus hindustanus的ble基因可以赋予藻细胞对Zeocin的抗性[32]， 该基因编码13.5 kD的蛋白， 能够与Zeocin结合抑制其活性[33]。在裸藻细胞内， 也有利用ble基因转化和Zeocin筛选的报道[34]。此外， 文献还报道了用aadA基因转化裸藻， 并用链霉素和壮观霉素筛选阳性转化子[35]，aadA基因编码氨基糖苷腺苷酸转移酶， 能够将ATP的腺嘌呤基团转移到抗生素分子上使其失活。

本实验室在利用基因枪方法转化含ble和NPTII的线性化质粒实验中， 得到了带有抗性的裸藻细胞单克隆， 它们分别能在含80 μg/mL Zeocin和250 μg/mL巴龙霉素的液体CM培养基中生长， 并且也能在同样抗生素浓度的固体平板上稳定生长和传代， 而野生型裸藻细胞在此抗生素浓度的培养基中是不能存活并传代的。

3 外源基因导入裸藻细胞的方法

除裸藻外， 莱茵衣藻等真核微藻的遗传转化体系已经有了较为系统的研究， 建立了多种转化方法，包括基因枪(Biolistic)、电穿孔(Electroporation)、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导， 以及玻璃珠研磨法(Glass beads)。

3.1 基因枪法

基因枪是通过高压气流将包被了DNA的微粒轰击进入细胞， 是目前最有效的转化方法之一， 其不受细胞类型的限制， 在转基因研究中应用广泛。该方法已经用于莱茵衣藻[36]、三角褐指藻[37]、杜氏盐藻(Dunaliella salina)[38]、拟微绿球藻(Nannochloropsis)[39]、团藻[40]， 以及裸藻近缘种锥虫[41]的转化。另外， 基因枪法可以高效地将外源基因导入细胞器， 例如， Boynton等[42]将野生型衣藻的atpB基因轰击到3株衣藻叶绿体atpB突变株中， 使其恢复了光合作用能力； Hu等[43]将抗性基因ble轰击到衣藻线粒体并稳定表达。

Doetsch等首先将Sanford等建立的基因枪法[44]进行改进， 并用于纤细裸藻的转化[35]， 主要步骤为:收集异养条件下生长到对数末期的裸藻细胞， 通过低压真空抽滤平铺到滤膜上(直径45 mm， 孔径0.22 μm)， 形成细胞薄层， 将滤膜转移到异养平板上， 2h内完成转化。用2.5 μg的质粒DNA包被M5型的钨粉颗粒， 用DuPont PDS-100/He型基因枪和7600 kN/m2的破裂膜， 设置3.4 kPa的真空度和12.3 cm的靶向距离， 对裸藻细胞进行一次轰击后， 将滤膜转移到筛选平板上， 约6周后挑取转化子。

Ogawa等[45]为了提高裸藻转化效率， 对基因枪转化的流程做了进一步改进， 如图 1所示， 主要步骤为: 离心收集对数生长期的纤细裸藻细胞， 用无菌水清洗后重悬， 用低压真空抽滤将细胞平铺到滤膜上， 将滤膜放置于CM培养基平板， 黑暗过夜。将0.25 μm的金纳米颗粒悬浮于100 μL无菌水， 加入6 μg的DNA， 100 μL 2.5 mol/L CaCl2， 40 μL 0.1 mol/L亚精胺， 4℃混合20min使DNA与金颗粒充分结合。用Bio-Rad PDS-1000/He型基因枪和900 psi的破裂膜， 设置9 cm的靶向距离， 对裸藻细胞进行一次轰击后， 用2 mL CM培养基洗下藻细胞， 光照复苏过夜后再涂布于筛选平板， 培养直至获得转化子。

图 1 基因枪法转化裸藻的流程Fig. 1 The procedure of biolistic transformation of E. gracilis

3.2 电穿孔法

电穿孔是利用高压电场击穿细胞膜， 瞬时提高膜的通透性， 外源核酸或蛋白分子在电场作用下扩散进入细胞。由于电穿孔技术操作简单、成本低，对细胞损伤程度小， 是细胞转化时优先选择的转化方法。在微藻研究中， 电穿孔技术具有比基因枪法更高的转化效率， 但针对细胞器的转化研究较少。莱茵衣藻[46]、小球藻[47]、三角褐指藻[48]、杜氏盐藻[49]、拟微球藻[50]， 以及衣藻近缘种锥虫和利什曼原虫[51]均已经建立了稳定的电穿孔转化方法。

Krajcovic等[34]报道了利用电穿孔技术将ble基因导入裸藻细胞， 但并未描述电击的条件。Iseki等参照锥虫的电穿孔条件， 进行改进后， 成功将双链RNA(dsRNA)分子导入裸藻细胞[52，53]， 主要步骤为:收集黑暗培养两天的裸藻细胞， 用无机盐培养基重悬， 取90 μL藻液(含有1×106细胞)转入0.4 cm间隙的电击杯， 加入RNA溶液混合， 用Bio-Rad Gene Pulser II电转仪， 设置电击参数为1.2 kV和25 μF， 室温放置30min后再接种到新鲜培养基中。Ishikawa等[54]将电压降到0.5 kV后仍然能够将dsRNA导入裸藻细胞， Nakazawa等[55]则将400 μL藻液(含有4×106细胞)转入0.2 cm间隙的电击杯， 使用BTX-ECM60型电转仪， 设置电击参数为0.5 kV和200 μF。

Ohmachi等[56]建立了裸藻单细胞电穿孔技术，即利用连接注射器的细口径微量吸管， 通过负压吸附固定单个裸藻细胞， 在吸管内置入电极和绿色荧光蛋白(GFP)等荧光探针， 施加方波电场成功将荧光探针注入单个裸藻细胞， 该方法所用电压较小为5—20 V， 脉冲时间为30—500 ms， 频率为1—5 Hz，持续时间为1—5s。

3.3 农杆菌介导法

土壤农杆菌能够自然地感染植物细胞， 并将其Ti质粒上的一段T-DNA插入到植物基因组中， 研究人员利用这一原理建立了农杆菌介导的转化方法[57]，并广泛应用于高等植物的基因工程研究。目前， 在莱茵衣藻[58]、小球藻[59]、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)[60]、杜氏盐藻[61]、拟微球藻[62]等微藻中也已经建立了农杆菌介导的转基因方法。日本研究者利用农杆菌介导将Zeocin、G418以及潮霉素的抗性基因导入裸藻细胞， 并在抗性转化子的基因组和转录组中检测到了相应的抗性基因， 该方法已经申请了专利[63]。

3.4 玻璃珠研磨法

Kindle[64]报道了通过玻璃珠研磨， 将ble基因导入细胞壁缺陷的莱茵衣藻， 获得了较高的转化效率。由于裸藻细胞没有细胞壁， 作者尝试用玻璃珠研磨法将含有NPTⅡ基因的pRI101-AN质粒导入纤细裸藻， 并用巴龙霉素筛选， 多次重复实验也没有获得阳性转化子， 推测原因是裸藻原生质膜结构坚韧， 难以通过研磨法形成有效穿孔。

4 裸藻的遗传转化

4.1 细胞核转化

Krajcovic等[34]首先报道了裸藻细胞核转化的方法， 将基因ble克隆到裸藻捕光色素复合体Ⅱ基因(lhcpII)的5′和3′末端之间， 使其受到lhcpII启动子的调控表达， 将该表达序列通过电穿孔或者基因枪转入裸藻细胞并在Zeocin平板上筛选， 所得转化子能够检测到ble基因， 并且可以稳定保存一年以上。

蓝细菌FBP/SBPase是同时具有果糖-1，6-二磷酸酶和景天庚糖-1，7-二磷酸酶活性的双功能酶，Ogawa等将FBP/SBPase与番茄核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(RbcS)的转运肽构建成融合蛋白， 用于叶绿体定位， 并将其表达框架克隆至植物表达载体pRI101-AN， 受到CaMV 35S启动子和NOS终止子的调控， 用基因枪将该重组质粒转入裸藻细胞，在巴龙霉素平板上得到的阳性转化子中能够检测到FBP/SBPase基因序列， 在转化子的叶绿体中也能检测到FBP/SBPase蛋白， 转化子在高光和高CO2条件下的光合效率， 以及裸藻副淀粉的积累量都显著提高[31]。作者采用该文献的方法， 单独用pRI101-AN线性化质粒转化裸藻细胞， 所得转化子能够长期保持巴龙霉素抗性， 但在基因组和转录组中均未检测到抗性基因NPTII， 分析原因可能是裸藻本身能够产生较强的抗生素耐受性， 因此， 阳性转化子需用多种方法进行鉴定。

4.2 叶绿体转化

Doetsch等[35]将aadA基因克隆到光系统II核心蛋白基因psbA的5′和3′末端之间， 使其受到psbA启动子的调控， 用基因枪将含有该表达框架的载体导入裸藻叶绿体， 并在含有高浓度链霉素和壮观霉素的平板上筛选转化子。由于链霉素和壮观霉素会抑制叶绿体蛋白质合成， 导致叶绿体发育受阻和藻细胞褪色凋亡， 只有导入了aadA基因并有效表达的转化子才能够保持绿色生长状态。根据这一表型，Doetsch等[41]获得了若干阳性转化子， 在其叶绿体中能够检测到aadA基因， 但该DNA片段并没有整合到叶绿体基因组上， 而是以游离元件的形式存在于叶绿体基质， 并保持了较低水平的表达。Doetsch等[41]还将含有叶绿体同源重组片段的载体导入到裸藻细胞中， 也取得了类似的结果。此外， 在锥虫的转化中也发现了这种外源载体以游离元件形式存在的现象[41]。由于裸藻的遗传背景尚不清楚， 外源载体在叶绿体内复制并稳定遗传的现象还无法解释。

5 RNA干扰技术在裸藻细胞内的应用研究

RNA干扰(RNAi)是由dsRNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象， 这是生物体内存在的一种基因表达的调控方式。利用这一机制， 可以人为构建目的基因的同源dsRNA， 导入细胞后实现特定基因的表达抑制。Iseki等[52]首次在裸藻中使用了RNAi技术来研究核基因的功能， 利用电转化将裸藻蓝光受体―光敏化腺苷酸环化酶(PAC)的同源dsRNA导入裸藻细胞， 显著降低了细胞内PAC的含量， 并且在细胞分裂几代之后依然有效。随后，RNAi技术在裸藻的基因功能验证中得到广泛应用，表 1展示了到目前为止利用RNAi技术在裸藻中开展的基因功能研究， 这些基因涉及裸藻的基本代谢、光响应、代谢物合成等各个方面。在这些文献中用到的导入DNA、基因克隆的方法等加以优化后可用于裸藻的遗传转化研究。

表 1 利用RNAi技术的裸藻基因功能研究Tab. 1 RNAi-based study of gene function of Euglena

6 问题与展望

裸藻独特的生物学特征使其具有重要的科研价值和经济价值， 但是无论遗传学研究， 还是工业化应用， 都离不开成熟的基因工程手段。国际上只有少数实验室开展了裸藻遗传转化的研究， 而且正式发表的文章数目极少。作者所在实验室对裸藻的遗传转化体系开展了较长时间的研究， 发现裸藻的稳定转化存在以下问题: (1)裸藻细胞在抗生素作用下容易产生较强的耐受性， 导致筛选失败； (2)外源DNA导入细胞后可能以游离形式存在， 不能实现基因组的插入突变， 而且外源DNA在细胞内的复制机理也不清楚。根据对文献资料的总结和分析， 作者认为裸藻的遗传转化有以下几个研究方向: (1)裸藻基因组测序完成后， 细胞核内外DNA的复制机制有待阐明； (2)通过使用高表达的启动子、密码子优化和内含子嵌入等多种方式构建更为高效的裸藻筛选标记， 以及多种用途的工具载体； (3)建立裸藻线粒体转化体系， 开展线粒体遗传特征的研究；(4)对CRISPR/Cas9、Cpf1等基因编辑工具(裸藻中尚未报道)进行优化后， 应用于裸藻的遗传改造。今后， 随着遗传转化体系的完善， 裸藻的基础生物学研究将会取得较大进展， 基因工程改造也将极大地促进裸藻的工业化应用和规模化生产。

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