镉对大型溞摄食能力和相关生理指标的影响

王 茜 郭鹄飞 王 兰

(山西大学生命科学学院， 太原 030006)

镉作为一种强致癌物质， 对水生生物的影响越来越受到人们的高度重视[1]。研究发现， 镉的半衰期长， 能够在动物体内蓄积并产生毒性， 对机体造成氧化损伤， 产生大量的自由基， 同时也增加细胞膜的通透性， 为其他重金属进入细胞提供便利[2，3]。镉会影响水生动物的摄食能力， 造成摄食率的降低或停止。例如， 侧扁软柳珊瑚(Subergorgia suberosa)在较低浓度的重金属(Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)胁迫下， 周期性活动或摄食的行为都产生异常， 在较高的浓度下使得珊瑚无法适应并导致死亡[4]； 水螅(Hydra peseudoligactis)摄食率在受到重金属离子(Cu2+、Cr6+、Zn2+、Cd2+、Pb2+)胁迫时也会受到抑制[5，6]； 安氏伪镖水蚤(Pseudodiaptomus Annandalei)在急性以及慢性重金属(Cu2+、Zn2+、Cd2+)中毒后， 摄食率会受到一定程度影响， 且雄性成体的摄食率普遍低于雌性成体的[7]。水生动物的摄食能力受到抑制将导致其营养物摄取量的减少，并对其生长和繁殖产生干扰。因此， 摄食能力是获得一切生命活动所必需的物质和能量的基础。同时， 也是水生动物毒性应激反应在生态上重要而敏感的指标。

在水生生态环境中， 大型溞(Daphnia magna)作为国际公认的标准试验生物， 已被广泛用于生态毒理学和水生生态学的研究[8]。大型溞在淡水生态系统食物网中占优越性地位， 且生殖周期短、繁殖迅速、对水体中有害污染物质敏感等特点也使其在水环境质量评价中得到普遍应用[9，10]。

鉴于此， 本实验研究了镉胁迫下大型溞的摄食率、滤水率、镉的蓄积量、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性。初步探讨了镉对大型溞摄食能力的影响及机制， 旨在为溞类摄食的深入研究、为水质监测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验中所用到的大型溞已经在标准条件下培养了2年以上， 其敏感度达到中华人民共和国国家标准《水质、物质对溞类(大型溞)急性毒性测定方法》(GB/T13266-91)[11]的要求， 培养大型溞的水温(20±1)℃、pH 7.2、溶氧量7 mg/L、光照周期光∶暗=16h∶8h； 普通小球藻(Chlorella vulgaris)藻种购自中国科学院淡水藻种库。

1.2 主要试剂

氯化镉(CdCl2.2.5H2O， 分析纯)购自天津市博迪化工有限公司， 实验前用双蒸水配成1000 mg/L母液； 标准镉溶液(1000 mg/L)由环境保护部标准样品研究所提供； 硝酸(优级纯， 北京化工厂)； 30%过氧化氢(分析纯， 天津市天力化学试剂有限公司)； 乙酰胆碱酯酶(AChE)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所； 蛋白含量测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.3 实验方法

实验设计依据国家地表水环境质量标准(GB3838-2002)[12]， Ⅴ类水质的镉浓度标准限值的1倍、5倍、9倍， 设置了3个镉浓度组(0.01、0.05和0.09 mg/L)、1个空白对照和2个处理时间(24h和48h)。除摄食率和滤水率的测定实验中大型溞喂食外， 其他实验处理期间不喂食。

摄食率与滤水率的测定在实验前选取大小一致、含卵的大型溞100只放入2 L的烧杯中培养， 18h后取走母溞， 24h时选择个体大小基本一致的120只一日龄幼溞(＜24h)， 每个实验组添加相同数量的小球藻和10只幼溞， 同时设置实验对照组(加入相同数量的小球藻但不加幼溞)。小球藻的初始密度为5×105cells/mL， 在光照培养箱培养， 温度(20±1)℃。参照光密度法测定镉染毒24h、48h后小球藻的密度。依据相应公式计算滤水率(F)和摄食率(I)[13]。

大型溞体内镉含量的测定参照火焰原子吸收法[14]测定大型溞体内的镉含量。

T-AOC、MDA含量和AChE活性的测定分别在染毒24h、48h取样。按生物量0.1 g/400 μL加入预冷的生理盐水， 在冰浴条件下用电动匀浆器制备匀浆液， 4℃、12000 r/min离心30min， 取上清液作为酶源。按照试剂盒提供的步骤对T-AOC、MDA含量、AChE活性和蛋白浓度进行测定。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)， 数据结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示， *P＜0.05表示显著性差异，**P＜0.01表示极显著性差异。

2 结果

2.1 镉对大型溞摄食率与滤水率的影响

如图 1所示， 大型溞的摄食率(图 1A)和滤水率(图 1B)随着镉浓度的升高均呈现下降趋势。镉处理24h， 浓度为0.09 mg/L时， 大型溞滤水率和摄食率与对照组相比显著降低(P＜0.05)； 而浓度为0.01 mg/L、0.05 mg/L时， 滤水率和摄食率无显著性差异。镉处理48h， 与对照组相比， 各浓度组滤水率均极显著降低(P＜0.01)； 摄食率也呈现显著性或极显著降低(P＜0.05，P＜0.01)， 且镉浓度为0.09 mg/L时，摄食率比对照组降低了43.89%。

图 1 镉对大型溞摄食率(A)和滤水率(B)的影响Fig. 1 Effect of cadmium on the ingestion rate (A) and filtration rate (B) in Daphnia magna

2.2 镉在大型溞体内的积累

由图 2可知， 镉在大型溞体内的蓄积量随着浓度的升高呈现上升趋势。与对照组相比， 镉处理24h、48h， 浓度0.05 mg/L时的蓄积量显著高于对照组(P＜0.05)； 浓度0.09 mg/L时的蓄积量极显著高于对照组(P＜0.01)； 浓度0.01 mg/L时没有显著性。通过相关性分析， 镉的蓄积量与浓度之间存在较高的相关性(R2=0.9903)(图 3)。

图 2 镉在大型溞体内的积累Fig. 2 Bioaccumulation of cadmium in Daphnia magna

图 3 镉在大型溞体内的积累量与镉浓度的相关性Fig. 3 The correlation between the accumulation of cadmium inDaphnia magna and its concentrations

2.3 镉对大型溞总抗氧化能力(T-AOC)和脂质过氧化(MDA)的影响

由图 4可见， 大型溞T-AOC随镉浓度的升高而增加， 具有浓度—效应关系。镉处理24h、48h， 浓度0.09 mg/L时， T-AOC与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。而且在镉处理后， T-AOC与摄食率之间呈负相关性， 相关系数R2分别为0.9521、0.9389 (表1)。

由图 5可知， 大型溞体内MDA含量随镉浓度的升高表现出上升趋势。处理24h， 浓度0.05 mg/L时，MDA含量较对照组有极显著差异(P＜0.01)。处理24h、48h， 浓度0.09 mg/L时， 与对照组相比MDA含量有显著差异(P＜0.05)。

2.4 镉对大型溞乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响

由图 6可看出， 大型溞体内AChE活性随着镉浓度的升高而降低。与对照组相比， 镉处理24h、48h，浓度0.01 mg/L时， 酶活力与对照组无显著性差异(P＞0.05)； 浓度0.05 mg/L、0.09 mg/L时， 酶活力显著低于对照组(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 镉的积累对大型溞摄食能力的影响

镉在大型溞体内的积累量具有浓度—时间效应， 尤其在浓度0.09 mg/L时， 大型溞体内的蓄积量极显著高于对照组(P＜0.01)。水体中的镉以带正电的Cd2+形式存在， 可经过体表直接进入大型溞体内[15]；另外， 也可吸附于小球藻通过摄食进入机体[16]。通过以上2种途径进入机体的镉一部分会被自身代谢，但大部分蓄积在体内， 从而对大型溞正常的生理功能产生影响。此外， 大型溞食用未被污染的藻类，肠道需要15—30min可以完全净化， 而食用被镉污染后的藻类后， 需要3—6h才能完全净化干净[17]， 表明镉污染后造成了大型溞肠道蠕动能力降低， 延长食物在肠道的停留时间。

图 4 镉对大型溞总抗氧化能力(T-AOC)的影响Fig. 4 Effect of cadmium on total antioxidant capacity (T-AOC)of Daphnia magna

表 1 镉胁迫下大型溞不同测定参数与摄食率的相关性分析Tab. 1 The correlation of feeding rate and different assays performed with D. magna for cadmium

图 5 镉对大型溞丙二醛(MDA)含量的影响Fig. 5 Effect of cadmium on malondialdehyde (MDA) content in Daphnia magna

图 6 镉对大型溞乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响Fig. 6 Effect of cadmium on the activities of acetylcholine esterase (AChE) in Daphnia magna

大型溞通过摄食来获得生命活动所必需的物质和能量， 从而保证其个体的生长、发育和种群的延续。当大型溞受到镉胁迫时， 摄食率可以很好的反映其摄食能力及能量物质的变化情况[18]。文献报道， 在大型溞摄取蓝藻后， 肠道内食物的充盈度相对于对照组来说不到58%， 肠道中叶绿素a含量是对照组的1/3， 表明大型溞的摄食行为受到抑制[19]。在本实验中， 在大型溞受到镉胁迫后较短的时间内， 低浓度镉对大型溞的摄食率与对照组相比无显著性差异。可能是短时间内， 较低浓度镉所造成的毒害能够被机体自身的抗氧化系统修复， 不会对机体产生伤害[20]。当较高浓度镉处理后， 大型溞的摄食能力受到抑制， 且摄食率与镉蓄积量存在相关性(R2=0.9354)(表 1)。此外， 小球藻作为食物对大型溞来说比较适口， 实验过程的环境条件(温度和光照)也都适宜其生长， 排除这些外在因素的干扰， 认为大型溞摄食情况变化是由于镉胁迫导致的。

3.2 镉对大型溞T-AOC、MDA与AChE的影响

T-AOC是衡量机体抗氧化酶系统和非酶促系统功能整体状况的综合性指标。当机体处于镉胁迫时， 过多的自由基使机体内许多重要的生物大分子发生不可逆的氧化损伤， 导致细胞结构和功能的破坏。而MDA作为脂质过氧化作用的最终分解产物， 可以反映在镉胁迫下氧化应激的严重程度[21—23]。镉诱导的抗氧化能力升高可促进ROS的清除过程； 反之， ROS的过度产生可以提高细胞或生物体中的MDA水平。在本实验中， 暴露于高浓度镉溶液的大型溞T-AOC和MDA含量高于对照组。MDA含量的升高表明镉的毒性对大型溞体内抗氧化防御系统造成了一定程度的损伤。而TAOC的升高是因为在大型溞受到镉胁迫后， 抗氧化酶系统在胁迫轻微时会被激活， 来维持机体自由基的代谢平衡。因此， T-AOC的提高为代偿性增高，用以清除镉胁迫后机体产生的过多的活性氧自由基。当氧自由基水平高于机体抗氧化能力时， 将诱发氧化应激， 并导致氧化损伤。脂质、蛋白质和DNA的氧化会对生物体组织器官造成不同程度的危害， 其中对消化道的损伤在动物中发生率最高[24]，而营养物质的消化吸收依赖于肠道蠕动及吸收细胞的完整性和消化酶活性发挥正常的生理功能。此外， 有研究报道， 摄食率的变化与氧化应激的相关性很高[25，26]， 这与本实验中镉胁迫后大型溞体内T-AOC与摄食率之间的相关系数达0.9521或0.9389的结果是相一致的(表 1)。所以镉胁迫后造成机体的氧化损伤， 从而干扰了大型溞对食物的消化与吸收。

乙酰胆碱酯酶是神经传导抑制剂的特异性生物标志物， 参与乙酰胆碱的降解， 使神经信号分子可以在生物体内正常传递[27]。当水环境中的毒物浓度较高时， 大型溞的神经系统会遭到破坏， 所以检测AChE活性变化可以用来反映水体污染的情况[28]。摄食行为是维持机体代谢处理稳恒状态的一种调节性行为， 大型溞在摄食时， 第1、第2对胸肢的运动带动水流和食物随进入壳瓣， 第3、第4对胸肢上的滤器将食物滤取并凝聚成食物团后被胸肢向上推动最终进入口中， 而后腹部及基部的尾爪不断运动将壳瓣内残留物清理出壳瓣[29]。在本实验中， 在较高浓度的镉(0.05 mg/L、0.09 mg/L)胁迫下大型溞体内AChE活性降低， 可能是Cd2+以静电吸引的形式与AChE活性中心的阴离子相结合， 造成乙酰胆碱的季铵阳离子基团与酶的活性中心结合的能力降低， 引起组织内AChE活性下降， 干扰了大型溞神经传递的正常功能。大型溞主要依靠其神经系统协调下的附肢划动完成摄食[30]， 毒物可以通过损害大型溞的神经系统限制游泳行为和附肢运动来影响其滤水能力[31，32]， 最终导致摄食率的降低[33，34]。这与本实验中大型溞暴露于镉环境较长时间后摄食率与滤水率降低是一致的。

4 结论

镉对大型溞的摄食能力具有抑制作用， 表现在摄食率和滤水率随镉处理浓度的升高而显著下降。大型溞受到镉胁迫后， 摄食能力降低的机制与体内AChE活性的下降， T-AOC水平的升高及MDA含量的上升有关。

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