基因突变导致的囊性纤维化及其疾病的研究进展

董校汝，王 贺，王 哲，吴明达，夏忠雪，周雁红，王鑫鑫综述,郝 峰审校*

(1.吉林医药学院，2.北华大学，吉林 吉林 132013)

囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)是一种依赖cAMP-ATP门控性氯离子通道，表达于气道、消化道和生殖道等多部位上皮细胞的顶部质膜中。囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)是白种人最常见的常染色体隐性遗传性疾病之一，多是由于ΔF508缺失突变造成的。对CFTR基因的不断研究使人们进一步了解CF的发病机制。

1 CFTR基因与CF疾病

1.1 CFTR基因概述

1989年ROMMENS等成功克隆并鉴定了CFTR基因[1]。CFTR基因位于7q31，长度250 kb,包含27个外显子，编码一条长度1480个氨基酸的肽链。CFTR是一种cAMP依赖的氯离子通道蛋白，属于ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白超家族中唯一的离子通道蛋白成员，分布于所有与分泌和吸收有关的组织上皮细胞顶膜，是液体分泌和细胞外碱化所需的氯化物和碳酸氢盐通道。ABC转运蛋白以各种形式普遍分布，其基本功能单位是两个核苷酸结合域(nucleotide binding domains,NBDs)和两个跨膜域(transmembrane domains,TMDs)。NBD上的ATP水解作用推动了TMD的构象变化，致使从细胞的内部和外部交替进入通道进行单向传输穿过双层脂质膜。所有的ABC转运蛋白都有一个与核酸结合相关的LSGGQ区。随着更多氨基酸序列信息的出现，人们认识到这些ATP结合域的主要结构是高度保守的，包含一个磷酸盐结合环(P-loop or Walker A motif)和短序列LSGGQ。这种保守的结构使得所有ABC转运蛋白在化学转运方面拥有很多共同的性质。进和出的ABC转运蛋白都是在细菌中发现的，而大多数真核生物家族成员都是在运出的方向上发挥作用的。同样CFTR转运蛋白单一多肽链上含有2个NBDs和2个TMDs，共同构成一个介导氯离子跨膜转运的通道。NBD2 WalkerA区域和NBD1 LSGGQ序列形成一个复合ATP结合位点用于水解核苷酸，然而NBD1 WalkerA区域和NBD2签名区结合不能水解核苷酸。CFTR在两个TMD-NBD盒之间包含一个大小为200个氨基酸的调节区R和NBD1 N-端插入30个不典型氨基酸残基。在最初的结构中，这30个插入残余物和30个残余物的扩增物被定为非典型的NBDs,并且含有体外蛋白激酶A磷酸化的位点，前者监管进入后者监管扩增[2-4]。当R区域被蛋白激酶磷酸化时，可以激活CFTR氯离子通道，ATP与CFTR-NBDs相互作用是激活该通道进行门控的关键步骤。在生物体中ABC转运蛋白的生理功能具有重要作用，如营养物质的吸收、排出毒素以及介导真核生物和细菌细胞间通讯等。

1.2 CF的病因

CF是由位于第7对染色体CF基因突变引起的常染色体隐性遗传病。病人的同胞中半数带有隐性基因，得病概率为1/4。研究显示，CF患者分泌物变黏稠的主要原因可能是：上皮细胞氯离子通道调节缺陷，从而会阻碍呼吸道黏膜上皮的水、电解质跨膜转运，黏液腺分泌物中酸性糖蛋白含量的增加，改变了黏液流变学的特性[3]。CF是一种“多向性”疾病，是指多个不同的不相关的临床表型是由同一个基因控制的。CF是一种影响多系统器官的疾病，但是有证据已经表明其中有一些的确与相应的基因突变有关。例如DeltaF508以及其他的一些突变与胰腺功能缺陷和慢性支气管扩张有很明显的相关性。到目前为止，已经有约2000个CFTR突变被论述。然而，DNA序列中的分子改变不等于蛋白质产物的表达或功能存在缺陷。有些CF疾病的基因型和表型之间尚未建立联系，所以不可一概而论。

1.3 CFTR与CF的联系

1.3.1CFTR基因突变导致离子通道异常

CFTR是一种存在于上皮细胞膜上的氯离子通道，它将氯离子运出上皮，到达内脏中各种通道的黏液中，正常情况下通道有维持黏液的正常流动的功能，在人体的各种管道都存在着CFTR。对于CF患者，钠离子和氯离子分泌随着异常的CFTR被阻断，导致通道黏液异常黏稠，比如痰液变得黏稠。同样，在皮肤的汗管，氯化钠不能被重吸收，从而产生非常咸的汗液，如薯片味的汗液。CFTR基因影响氯离子通道功能导致上皮流体在输送到肺、胰腺和其他器官功能失调，最终导致CF的突变[1,3]。CF会出现一系列的并发症，最终导致慢性残疾和寿命缩短，其中包括频繁的呼吸道感染和胰腺功能不全引起的营养不良和糖尿病肺部黏液增厚。

1.3.2CFTR突变的类型

目前，已经报道的导致CF的CFTR基因突变有2000多种。但目前基因型和表型关系尚不明确，有待进一步研究。为更好理解基因型及表型关系，根据这些基因突变的分子机制及其产生后果将突变的CFTR基因分为以下6类，具体分类如下:Ⅰ类和Ⅱ类突变的主要特点是使CFTR在上皮细胞表达的数量减少。Ⅰ类突变是无意义的突变导致不稳定mRNA转录和蛋白质生成。对于这一类的突变导致“通读”的分子使核糖体通过过早的终止密码子继续翻译产生完整的CFTR蛋白,使正常的CFTR序列增加，如G542X、R553X等。Ⅱ类突变是CFTR蛋白折叠或成熟的缺陷，导致缺陷的CFTR在内质网被过早地降解而不能被正常运输至顶膜处发挥作用，此类型包括CF最常见突变ΔF508del，即第508位氨基酸密码子突变。Ⅲ类和Ⅳ类突变表现为CFTR通道功能异常。Ⅲ类突变是门控突变，在膜表面调节蛋白质减少了负离子传输，CFTR的调节区破坏，CFTR被磷酸化从而与ATP不能正常结合，影响通道的激活，如G551D、G1349D等[5]。Ⅳ类突变的CFTR通道能正常打开及关闭，但其孔隙构象异常，导致氯离子的转运异常，如R117H、R334W等。Ⅴ类突变是RNA剪接异常，正常功能的CFTR蛋白大量减少，例如A455E、P574H等[2-3,5]。Ⅵ类突变是最近发现，在细胞表面CFTR的稳定性降低，周期增加。突变显示多类的特征。例如，虽然F508del的主要是细胞处理异常，但也表现出门控缺陷和细胞表面半衰期减少。

2 CF的临床症状

2.1 呼吸系统表现

2.2 消化及营养不良

2.3 生殖系统和胰腺表现

CF在生殖系统方面也造成了一些困扰。CF患者宫颈黏液异常、无精症和先天性输精管缺失是导致女性生育能力下降和男性不育的主要原因。患者黏稠的分泌液常常会阻塞连接睾丸和前列腺的管道即输精管，会导致许多男性CF患者不育。女性患者与正常女性相比，CF患者的生殖能力也会下降[3,11]。在人类的外分泌胰腺中，CFTR主要分布在导管细胞的顶端质膜上，并控制着由cAMP调节的碳酸氢盐分泌到导管腔内。在胰腺中，CFTR的主要作用是稀释和使富含蛋白质的腺泡分泌到管道腔内，从而阻止蛋白质栓的形成造成胰腺损伤。CFTR基因突变尤其是F508del，是患慢性胰腺炎的风险因子。可见CF患者全身多器官都会出现一些列临床症状，影响人类正常生活。

3 针对CF症状和CFTR突变类型的治疗方法

3.1 CF症状的治疗

CF的治疗目前主要是针对临床表现和并发症，并且主要是针对患者呼吸系统疾病。有以下几种治疗方法,但治疗的主要目标都是一致的：防止呼吸道感染，减少肺部黏液的分泌液量和黏稠度，改善呼吸，维持足够的营养[12-13]。根据以上宗旨，现阶段CF的治疗可以概括为3种：1)针对CF患者的肺部易感特点，使用新一代的抗生素喷雾剂可以将药物直接送到气道发挥作用，更高效方便。然而，长时间的高剂量的氨基糖苷类抗生素会导致严重的肾毒性和耳毒性。并且长期使用抗生素的一个最大问题是细菌的抗药性，使抗生素逐渐失去作用。因此，要合理使用抗生素。通过加用沙丁胺醇喷雾等支气管扩张药物作用于患处，可以清除黏稠的痰液维持气道的开放。2)针对消化不良的患者，由于CF会使消化所需的胰腺酶无法到达消化道，食物消化和吸收障碍，导致营养不良。因此患者应该合理饮食,多补充高能量的营养素、脂溶性维生素，以及有效的胰腺酶，增加营养。3)针对严重肺部并发症并且使用抗生素治疗无效时，此时可以进行肺移植。

3.2 ΔF508del突变的治疗

ΔF508del突变约存在于90%以上的CF患者中，是白种人最常见突变类型，属于Ⅱ类突变。纠正ΔF508del突变相关的CFTR异常即Ⅱ突变是一个更大的挑战。针对ΔF508del突变必须同时调节CFTR处理缺陷和门控缺陷。Orkambi是由lumacaftor和Ivacaftor组成，其中Lumacaftor(VX-809)是CFTR修正者，具有保护ΔF508del突变携带者的CFTR蛋白免遭降解的药物[14]。Lumacaftor是CYP3A的强诱导者，相比组合疗法Ivacaftor单疗法意味着更大剂量的Ivacaftor，即CYP3A的底物，而这种组合疗法较比Ivacaftor单疗法需使用较少剂量的Ivacaftor即可达到临床治疗效果。体外研究表明，Lumacaftor的校正活性及选择性均较高，现已进入到临床研究阶段。实验采用单独使用Lumacaftor和与Ivacaftor联合使用治疗CF。结果表明：Lumacaftor治疗组的肺功能均较安慰剂组有显著改善，且耐受性好，治疗组的不良反应发生情况与安慰剂组相似。600 mg VX-809与Kalydeco联用治疗的患者肺功能改善情况最佳。此外Lumacaftor系列新产品VX-661也进入了Ⅲ期临床。还有多款候选药物还在进一步开发，其中包括一款基因治疗药物[15-16]。对其单独给药以及替代Lumacaftor与CFTR增强剂联合给药对ΔF508del突变成年携带者的疗效进行评估,Ivacaftor可以帮助CFTR蛋白通道打开的时间更久一些，以使盐分和水分更好地进出细胞。CF患者终生与其疾病相伴，多因肺部感染而反复，疾病会变得日益严重。Lumacaftor和Ivacaftor的合剂代表了CF治疗的一个跳跃性突破，因为它能够解决该疾病的病因[17]。那些以复方药物Orkambi治疗的患者其肺功能经历了明显的改善，肺部恶化程度降低。药物QR-010是由ProQR开发的治疗，它是单链反义RNA寡核苷酸序列，可以修复异常mRNA Phe508del突变的病人。

3.3 CF的其他治疗方法

对CF的终极治疗是基因疗法，用正常CFTR基因代替突变的CFTR。Kalydeco(Ivacaftor)是全球首个CF靶向治疗药物，但适用人群较少。美国FDA批准Kalydeco用于2～5岁患有囊性肺纤维化的儿童。这款药物被批准用于CF儿童，适用于拥有10个CFTR基因突变(G551D、G1244E、G1349D、G178R、G551S、S1251N、S1255P、S549N、S549R和R117H)之一的患者。Ivacaftor是一种新型的CFTR增强剂，通过增加CFTR蛋白质的开放概率，增加了氯化物的运输。Ivacaftor的使用可以改进报告病人的肺功能、体重和呼吸系统症状，减少了肺恶化的频率，降低汗液氯化物浓度使之低于诊断阈值。PTC124(Ataluren)在结构上与氨基糖苷类抗生素相似，但这种化合物没有该类抗生素的化学性质。最初PTC124在人类的肌肉细胞中促进肌肉萎缩蛋白产生，在老鼠模型中表达肌萎缩蛋白无意义等位基因。随后的体内实验发现，PTC124可以抑制CF小鼠模型中G542X的无义突变，表达人类CFTR-G542X基因，恢复CFTR表达和功能。PTC124的药理作用是阻止新出现的终止密码子信号从而不影响正常终止密码子，主要适用于Ⅰ类突变患者[14,17]。研究结果表明PTC124明显改善肺功能，同时在CF疾病引起的咳嗽方面也有所改善。以寡核苷酸为基础的药物纠正DNA或RNA缺陷，从而产生正常的CFTR蛋白。基因治疗的最大优势是不受CFTR突变类型的限制,并且正常CFTR的cDNA进入气道可表达为功能正常的CFTR，因此基因治疗在理论上可以治疗所有CF患者的气道疾病。研究显示，治疗方法耐受性很好，而且与安慰剂组的肺功能丧失相比肺功能也稳定了。在这个领域进行了20多年的研究，对于CF基因疗法仍然需要更有效的载体将cDNA注入呼吸道细胞，这是一个至关重要的挑战。体积调节性阴离子通道(volume regulated anion channel,VRAC)的研究已经有20多年，但这个通道的分子实体直到最近才被发现[18]。除了稳定细胞体积的作用外，VRAC还涉及许多其他的生理和病理生理过程，包括癌症、缺血性脑水肿、细胞活力、增殖、血管生成、程序性细胞死亡和兴奋性谷氨酸释放。尽管VRAC在生物物理、药理学和功能上都具有广泛的生物特性，但它的分子特性一直备受争议。直到最近才发现含有8A(LRRC8A)蛋白是富含VRAC蛋白质，在多种细胞类型中是必需的，而且是VRAC形成的一个的子单元。2014年，在最后一次突破中，两组独立地确认了LRRC8A是VRAC不可或缺的组成部分。低渗情况下细胞膨胀，通道被激活，当电流电压瞬时产生，体积敏感性氯离子通道普遍向外整流，膜电流达到兴奋时产生更大的离子流，膜兴奋状态下，离子流随时间推移逐渐减小，但在细胞更兴奋的状态下，通道会加速失活[19-20]。VRAC的研究进展也对CFTR突变相关疾病的治疗做出了参考。近年来其他方面如激动其他氯离子通道(TMEM16A)、ENaC抑制剂(阿米洛利、VX-371)等也有新药物发现。

4 结 语

CF是一种累及全身多器官系统的恶性疾病，随着对CF发病机制、临床表现的认识及基因检测技术等的进步，CF的治疗方法在不断更新。CFTR基因突变的发现，使得纠正CFTR缺陷这一源头问题的治疗研究应运而生，虽然基因治疗研究经过多年后仍未实现，但药物治疗方面已取得了突破性的进展。目前和未来的治疗靶点主要集中在纠正CFTR蛋白的结构和功能异常上。此外，一些有症状改善的药物也在研究中。针对不同类型CFTR基因突变的治疗为CF的治疗不断更新和变化。新型药物Orkambi(lumacaftor/ivacaftor)，尤其是针对覆盖90%F508del为主的CFTR突变，是目前公认替代基因治疗最有前途的治疗策略。对于其他CFTR突变类型所致一整类疾病治疗，新合成的氨基糖苷类药物(包括NB54和NB84等)具有较庆大霉素药效强、毒性作用低、给药途径方便等优点，值得临床推广。值得一提的是，加强CFTR以外的氯离子通道也可有效缓解CF的症状，所以可以通过研究不同的氯离子通道来寻找更多的治疗药物。

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