贝母提取物对异丙肾上腺素致小鼠心肌纤维化的作用*

裴宸晨，李 乐

（1.浙江工业大学药学院药剂14级，2.浙江工业大学药学院药理研究所，杭州310014）

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是心脏成纤维细胞数量增加，心肌间质胶原过度沉积所致。MF破坏心脏功能，可促发充血性心力衰竭、恶性心律失常和猝死。MF常继发于冠心病、高血压等心血管疾病，也是心室重构发展难以逆转的重要原因，因此预防及控制MF具有重要的临床意义［1］。

传统中药贝母能清热止咳化痰。现代研究证明其在抗炎、抗肿瘤、降血压、抗氧化等方面药理活性强，尤其抗炎方面［2］。贝母在抗炎，抗氧化等方面效果显著，由此推测其可能对MF具有防治作用。为此本实验观察贝母提取物（fritillaria extract，FE）对小鼠MF的影响，探讨其治疗异丙肾上腺素（isoproterenol，Iso）诱导MF作用及其可能机制，此类实验国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康昆明种小鼠，18～22 g，雌雄兼用，浙江省实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）20160013；光照 12 h，明暗交替，正常饮食饮水，实验处置符合动物伦理学标准。

1.2 药品、试剂及主要仪器

FE，浙江省湖州生物技术公司，生料比10∶1；Iso，上海禾丰制药有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒，南京建成生物公司；山羊抗鼠TGF-β1多克隆抗体、辣根酶标记兔抗羊IgG抗体，武汉博士德生物技术公司；倒置显微镜XDS-1B型，重庆光学仪器厂；Synergy H1多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；80-2型低速离心机，上海医疗器械集团公司。

1.3 小鼠MF模型复制及实验分组、给药

昆明种小鼠40只，随机均分为对照组、Iso模型组、Iso+FE 300 mg／kg组、Iso+FE 900 mg／kg组（n＝10）。除对照组外，其余各组每只小鼠 i.h Iso 1.5 mg／kg（0.3 ml／d），连续 14 d，对照组s.c等量生理盐水；同时，Iso+FE低、高剂量组分别0.4 ml／d，0.9 ml／d灌胃 FE，连续 30 d，而对照组和 Iso模型组以等量生理盐水灌胃。

1.4 心重指数测定

实验结束后，小鼠称重，眼球取血，3 000 r／min，离心 10 min，取上清液用于SOD，MDA测定；处死小鼠取心脏，称重，计算心重指数（heart weight／body weight，HW／BW）。

1.5 生化指标检测

1.6 左心室组织病理学检查

每组取10只小鼠心尖组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋制成5μm切片，分别进行HE及Masson染色，显微镜观察下心肌组织学的改变。

取上清液，按照试剂盒说明书严格操作，测定SOD活性及MDA含量。

1.7 免疫组化法检测小鼠心肌组织TGF-β1蛋白表达

取小鼠左心肌组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片。然后脱蜡、水化，3%H2O2室温封闭10 min，羊血清封闭液室温封闭30 min。滴加各种1抗（TGF-β1），4℃湿盒过夜，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后滴加1∶100辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgGⅡ抗，室温孵育30 min，PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶，DAB显微镜下控制显色，苏木素复染。显微镜观察细胞质中棕黄色颗粒（TGF-β1阳性）、摄像，Quantity One分析软件测定阳性颗粒光密度值。

1.8 统计学分析：

采用SPSS 19.0统计软件分析，实验数据以均数±标准差（±s）来表示，多组间数据用One-way ANOVA方法分析，两组间比较采用 t检验。

2 结果

2.1 心重指数的变化

与对照组相比，Iso模型组小鼠心重指数明显增加（P＜0.01）；经FE治疗后，与Iso模型组相比，FE高、低剂量组心重指数明显降低（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

2.2 小鼠血清SOD活性、MDA含量

与Iso模型组比较，Iso FE治疗组小鼠血清SOD活性明显升高（P＜0.05），而 MDA含量显著降低（P＜0.05，表 2）。

Tab.1 Changes of heart weight index of mice（±s，n＝10）

Tab.1 Changes of heart weight index of mice（±s，n＝10）

FE：Fritillaria extract；Iso：Isoproterenol；HW：Heart weight；BW：Body weight*P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs iso model group

Group Dose（mg／kg） BW（g） HW（mg） HW／BW（mg／g ）Control - 26.12±3.34 114.36±16.06 3.73±0.46 Iso model - 23.60±7.79 112.67±34.30 4.85±0.50**Iso+FE 300 31.80±2.17 143.97±9.01 4.54±0.37#Iso+FE 900 28.03±2.90 117.06±10.60 4.14±0.31##

Tab.2 Levels of SODand MDA in serum of mice（±s，n＝10）

Tab.2 Levels of SODand MDA in serum of mice（±s，n＝10）

FE：Fritillariaextract；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Isomodel group

Group Dose（mg／kg） SOD（U／ml） MDA（nmol／ml ）Control - 49.54±6.86 289.41±83.43 Iso model - 41.42±11.12*321.18±31.09*Iso+FE 300 45.16±2.27#298.38±41.04#Iso+FEt 900 55.25±7.58##293.93±31.28##

2.3 左心室组织病理学变化

对照组心肌组织排列整齐，间隙正常；Iso模型组细胞间隙增加，炎性细胞浸润，形态不规整，胞核深染；比较Iso模型组，FE给药组炎性浸润程度均不同程度下降，胞间间隙减小，坏死或膨大细胞减少（图1，见彩图页Ⅱ）。

Fig.1 Changes of cardial tissues in eacy group（HE ×100）

Masson染色显示心肌组织胶原纤维呈蓝绿色，心肌纤维呈红色。对照组心肌细胞形态正常，纤维排列致密整齐，模型组有大量胶原纤维沉积并向邻近肌束延伸，Iso+FE治疗组虽仍有胶原沉积，但较Iso模型组胶原沉积显著减少，炎症明显减轻（图2，见彩图页Ⅱ）。

Fig. 2 Pathology changes of cardial tissues in each group mice（Masson ×200）

2.4 免疫组化法检测TGF-β1表达的变化

Iso模型组棕褐色颗粒TGF-β1表达明显高于对照组，呈强阳性反应。与对照组相比，FE低剂量治疗组TGF-β1蛋白表达水平仍较高，但与Iso模型组相比降低。而高剂量FE组TGF-β1蛋白表达则显著减少（图3，见彩图页Ⅱ）。

Fig. 3 Expression of TGF-β1 on cardial tissues of each group（Immunohistochemistry ×100）

3 讨论

MF主要以心肌纤维细胞异常增殖与细胞外基质（ECM）大量沉积为重要特点的病理改变，是多种心血管疾病共同的病理基础；目前临床多用β肾上腺素受体阻断剂，血管紧张素转化酶抑制剂等对抗，疗效不佳且难以持久用药［3］。

本研究显示，应用Iso造模后，FE高剂量组心重指数，与Iso模型组比较明显减小，表明FE能有效地抑制模型小鼠的心肌肥厚。

本实验证实FE对Iso所致MF小鼠的心肌细胞纤维化程度、炎性浸润水平均有改善，且升高血清 SOD活性，降低MDA含量。推测FE可能通过清除氧自由基，减轻脂质过氧化损伤，对心肌肥厚及MF起到保护作用。

大量研究显示，在心肌损伤时，成纤维细胞被激活增殖为肌成纤维细胞，TGF-β1等活性分子促进MF，刺激成纤维细胞活化，上调I、III型胶原合成并抑制胶原酶释放，调节细胞外基质，增加纤维蛋白胶原和蛋白聚糖，抑制细胞外基质降解；通过下游Smad信号通路调节纤维化相关基因的转录［4］；同时，TGF-β1介导 RAAS活化 Ang II升高诱导的 MF［5］。本实验提示FE可以抑制Iso诱发的心肌组织成纤维细胞活化，下调 TGF-β1蛋白表达。

综上所述，本实验证实，FE能有效对抗Iso诱发的MF，降低Iso造成的血清SOD活性降低，升高MDA含量。其抗MF机制与FE清除氧自由基，减轻脂质过氧化损伤，抑制TGF-β1表达有关，其深层机制待进一步研究。

【参考文献】

［1］ Broberg CS，Burchill LJ.Myocardial factor revisited：The importance of myocardial fibrosis in adults with congenital heart disease［J］.Int J Cardiol，2015，189：204-210.

［2］ Yu Q，Zhang Y.Transforming growth factor-β1 mediates NADPH oxidase 4：A significant contributor to the pathogenesis of myocardial fibrosis［J］.Int J Cardiol，2017，227：53-54.

［3］ Gao X，He X，Luo B，et al.Angiotensin II increases collagen I expression via transforming growth factor-beta1 and extracellular signal-regulated kinase in cardiac fibroblasts［J］.Eur J Pharmacol，2009，606（1-3）：115-120.

［4］ 张冠军，张蔚屏，王开成，等.厄贝沙坦对抗糖尿病大鼠心肌纤维化作用及机制［J］.中国应用生理学杂志，2016，32（3）：220-224.

［5］ Li Y，Yang Y，Yu D，et al.The effect of tanshinone IIA upon the TGF-beta1／Smads signalingpathway in hypertrophicmyocardium of hypertensive rats［J］.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29（4）：476-480.