5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）对丙酸杆菌生长及合成脱氧腺苷钴胺素的影响

王鹏 李路伟 郭金凤 徐凯莉 董哲

摘 要：在丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）厌氧发酵生产脱氧腺苷钴胺素（deoxyadenosylcobalamin，简称ADO）的过程中，中间体腺苷钴啉醇酰胺（adenosylcobinamide，简称CBI）和5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）结合后生成产物ADO。目前维生素B12脱氧腺苷钴胺素发酵过程中的实时在线检测方法相对匮乏，为了解决该问题，提高维生素B12的发酵单位，以CBI为目标，运用代谢调控方法改善DMB的加入时间，研究不同时间加入DMB对丙酸杆菌生长以及ADO合成的影响。在分批次发酵情况下，实时检测了菌体发酵过程中具体的CBI合成量、ADO产量，并进一步绘制了菌体的生长曲线。结果表明，DMB对丙酸杆菌生长的抑制作用并不明显，但是可以抑制单位菌体产量，发酵周期为120 h，最佳添加时间为90～100 h，相比60 h添加DMB可提高发酵单位59.08%。方法简便、快捷、高效，对维生素B12的发酵调控研究具有一定的参考价值。

关键词：发酵工程;脱氧腺苷钴胺素（ADO）;丙酸杆菌;腺苷钴啉醇酰胺（CBI）;5，6-二甲基苯并咪唑（DMB）

中图分类号：Q815 文献标志码：A

文章编号：1008-1542（2018）06-0546-06

维生素B12别称钴胺或氰基钴胺，是一类含钴的咕啉类有机化合物的总称，主要以5种天然形式存在：甲基钴胺（methylcobalamin）、脱氧腺苷钴胺（deoxyadenosylcobalamin）、羟基钴胺（hydroxycobalamin）、水合钴胺（aquacobalamin）和硝基钴胺（nitrylcobalamin）[1-2]。广泛应用于商品用途的维生素B12是由细菌菌体发酵合成的钴胺素转化而来的[3-4]。维生素B12与人们的生产、生活联系密切，例如在农业上主要用作饲料添加剂，在临床上用来治疗神经系统疾病和恶性贫血等。

目前，工业生产中的脱氧腺苷钴胺素（ADO）发酵采用好氧和厌氧工艺。第1种工艺是假单孢菌好氧发酵，发酵单位较高，但发酵过程需要曝气及高功率搅拌，能耗较高。第2种工艺则为丙酸杆菌厌氧发酵，虽然厌氧发酵工艺产率较低，但发酵过程中不需要曝气和高功率搅拌，能耗较低。工业上应用最普遍的维生素B12产生菌之一是丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）[5-7]，在其生长发酵中不会产生内、外毒素[8]，

发醇废液含有细菌类物质及丙、乙酸盐类，都具有生物抗菌作用，可作为天然、绿色、安全的食品和饲料防腐剂[9]，符合美国食品和药物管理局GRAS标准。综合考虑2种发酵工艺的成本相差不大，故选择丙酸杆菌厌氧发酵工艺。丙酸杆菌厌氧发酵生产ADO分2个阶段：第1个阶段，以增加菌体数量为目的培养发酵菌体，同时积累中间产物腺苷钴啉醇酰胺（CBI）;第2个阶段，向培养基中加入5，6-二甲基苯并咪唑（DMB），促使菌体合成维生素B12脱氧腺苷钴胺素[10-11]。相关研究讨论了DMB合成以及在生产中添加DMB的必要性[12-14]。

目前对于维生素B12的厌氧发酵过程，企业缺乏实时在线监控方法，大多采用镜检，人为影响因素较大，发酵不稳定。此外，关于在发酵生产维生素B12的过程中，添加DMB是否对丙酸杆菌生长有影响，以及在什么时间添加DMB可得到最优产量的研究并不多。笔者采用简便、快捷、高效的液相色谱实时在线监控方法，探讨了添加DMB对菌体生长及合成ADO的影响，并运用代谢调控的方法对发酵过程进行优化，提高了维生素B12的发酵单位。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

菌种丙酸杆菌Propionibacterium freudenreichii，CICC：10019，由中国工业微生物菌种保藏中心提供。

1.2 培养基配方

种子培养基配方（质量分数，下同）：葡萄糖3.5%（需要单独灭菌），玉米糖浆2.1%，碳酸钙0.4%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸铵0.5%，氯化钴0.000 5%。用自来水配制，pH值为6.8～7.0，加碳酸钙。

发酵培养基配方：葡萄糖6%，玉米糖浆4%，磷酸二氢钾0.46%，氯化钴0.001 27%。用自来水配制，pH值为6.8～7.0，加碳酸钙。

1.3 主要设备和试剂

美國Waters公司 2695高效液相色谱仪，Beckman C18（4.6 μm×25 cm，5 μm）色谱柱，福特斯（FTS）冷冻干燥机，Sigma 3K30高速离心机，Sartorius arium 611UF纯水机，Beckman J6-MC大体积离心机，Sonics & Materials公司生产的Uibracell超声波细胞破碎仪。

标准品ADO来自于Sigma公司;乙腈，色谱纯;冰乙酸，色谱纯;氢氧化钠，分析纯。

1.4 丙酸杆菌的发酵

取穿刺培养的细菌，用生理盐水冲洗，接种到种子培养基，在30 ℃静置培养50 h。取10%的种子液接种到发酵培养基中，在30 ℃下发酵培养，用氨水调节pH 值为6.8～7.0。在细菌菌体发酵过程中于不同时间加入DMB，促使丙酸杆菌积累ADO。

1.5 丙酸杆菌的收集与处理

在离心转速4 000 r/min时收集丙酸杆菌发酵液，菌体冻干。取单位质量的干菌配制成2.5%的悬浮液，然后在沸水浴中加热30 min使细胞破壁ADO释放。在转速10 000 r/min离心收集上清液，取1 mL通过0.2 μm纤维素滤膜过滤，最后用高效液相色谱仪检测ADO产量[15]。整个操作过程在避光下进行，以防止光降解。

1.6 分析方法

1.6.1 生物量的测定

采用7200型分光光度计测量吸光度。取1 mL发酵液，参数波长为600 nm，光程1 cm比色皿比浊，以OD表示生物量。

1.6.2 CBI及ADO的检测方法

液相条件：流动相1为乙腈，流动相2为醋酸钠缓冲液（pH值为3.5），检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

洗脱条件：15%乙腈恒速洗脱5～10 min，15%～30%乙腈梯度洗脱10～15 min。

质谱条件：喷雾电压为4.5 kV，自加热金属毛细管温度为300 ℃，电喷雾离子源壳气速为50 arb。全扫描检测模式，扫描范围为m/z 300～1 200，精确质量数与二级质谱（MS/MS）的扫描方式为数据依赖型。

全部数据是经3次试验所取的平均值。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中CBI的合成研究

笔者在原有实验基础上，已经得到一个关键且稳定的中间体，并通过光谱和液-质联用分析推测此中间产物为腺苷咕啉醇酰胺（CBI），相对分子质量为1 239。CBI结构如图1所示。研究发现，丙酸杆菌在发酵过程中，CBI随菌体的生长而积累，到一定程度时加入5，6-二甲基苯并咪唑（DMB），可以快速转化为维生素B12即ADO，但是不加DMB，丙酸杆菌将不能生成ADO[16]。

对中间产物采用液-质联用分析，结果如图2所示。

该中间体在被离子化后呈现出了+1价，相对分子质量为1 239.5，恰好同ADO-CBI厌氧生物合成途径中的脱氧腺苷钴啉醇酰胺（ADO）一致。ADO-CBI的分子结构中相对于ADO-CBI缺少了磷酸基团、核糖基团以及DMB基团（ADO-CBI分子质量比为1 580）。另外，图2中988.7 nm处对应的峰同ADO-CBI缺少了腺苷（ado-）基团的钴啉醇酰胺一致。由此可以得出结论：从实验中分离得到的关键中间产物应该是CBI。图2中，1 240.6 nm处对应的是CBI的加H峰。

2.2 DMB添加时间对ADO合成的影响

发酵过程中以不添加DMB为对照，分别在24，36，…120 h（间隔12 h）添加DMB，在120 h左右发酵结束后检测最终ADO合成量，对照定时取样测定CBI的合成量和OD值。结果如图3和图4所示。

由图3可以看出，在丙酸杆菌厌氧发酵生产ADO的过程中，OD值一直增大，在90～96 h之间生物量OD值最大，最后逐步平稳;CBI在60 h前后初次生成，90 h达到了最大值，随后略微减小。由图4可知，ADO合成量与CBI的生成有密切联系，在84 h CBI的合成量达到最大时添加DMB，合成终止后ADO可以达到最大产量;对比在60 h加入DMB，维生素B12即ADO产量可以提高59.08%，产量大幅提高，效果明显。

2.3 DMB对合成CBI的影响

2.3.1 DMB在CBI最大量左右时加入

在丙酸杆菌厌氧发酵生产ADO的过程中，以不加入DMB为对照，在96 h时加入DMB，全过程按小时定时取样测定生物量OD值、CBI以及ADO合成量。结果如图5所示。

由图5可知，随着发酵的进行OD值不断升高，在96 h时到达最高值，后续逐步稳定。对照中間产物CBI在60 h前后开始生成，96 h达到最大值，然后有小幅度降低，但仍保持在较高的水平。在96 h加入DMB后CBI不断减少，同时开始生成钴胺素ADO。随着反应的进行ADO合成量越来越多，123 h 时CBI彻底消失，ADO达到最大量，在124 h中间产物全部转化成产物脱氧腺苷钴胺素。

2.3.2 DMB不在CBI最大量时加入

在丙酸杆菌厌氧发酵生产ADO的过程中，以不加入DMB为对照，于74 h时加入DMB，全过程定时取样测定生物量OD值、CBI以及ADO合成量。结果如图6和图7所示。

由图6可知，未加DMB和加DMB两者的OD值都持续增大，在90 h时到达最大值后逐步稳定，加不加DMB对OD值的变化没有直接的影响。由此可知，DMB对丙酸杆菌的毒害效应不是很明显。加与不加DMB的发酵液两者的OD值不同，但无明显规律。对照CBI不断生成，在96 h到达最大量后逐步稳定。由图7可知，添加DMB后，CBI量快速减少，此时产物ADO开始生成并且产量逐步增大。在102 h 时CBI彻底消失，ADO产量在108 h达到最大值。由此可知，由CBI全部转化为ADO大约需要34 h。

2.4 DMB对细菌菌体生长的影响

在丙酸杆菌厌氧发酵生产维生素B12的过程中，DMB分别于发酵早期0 h，24 h和对数生长期48 h加入，以不加入DMB为对照，全过程定时取样测定生物量OD值（间隔12 h）、CBI以及ADO合成量，检验分析DMB对丙酸杆菌菌体的生长是否有毒害作用。结果如表1和图8所示。

由表1和图8可以看出，DMB对细菌生长有略微的毒害作用，但是作用并不明显。在菌体厌氧发酵完全结束停止后测定脱氧腺苷钴胺素ADO的产量，综合分析可知DMB加入的时间越早，ADO的产量越低。

优化发酵过程也可从代谢工程的角度出发，利用基因工程操纵代谢途径[17]，在丙酸杆菌厌氧发酵脱氧腺苷钴胺素的过程中，强化目标产物途径，控制或消除副产品途径[18-19]，特别是对ADO发酵过程中的丙酸杆菌、副产物丙酸抑制菌体的生长[20]，从而进一步影响ADO的发酵单位。因此，新型发酵工艺是另一种可以显著提高ADO产量和效价的途径，比如采用产物原位分离技术[21-22]。

3 結 语

1）目前，在维生素B12的发酵生产中，添加DMB的时间只是根据生产经验进行判断，并没有较为科学的理论可遵循。笔者认为，可采用生物发酵代谢工程手段来确定适宜诱导物DMB的加入时间，从而得到更高的发酵单位。例如：随着丙酸杆菌菌体的生长发酵，CBI在菌体内持续生成并不断累计，该合成直接关系到ADO的最终产值;在丙酸杆菌厌氧发酵生产维生素B12的过程中，全程定时取样跟踪检测CBI产量，当其生成量到达最大值时加入DMB，CBI将快速转化生成产物ADO，有效提高了发酵单位。在发酵90～96 h添加DMB，维生素B12的产量可以提高到59.08%。

2）在丙酸杆菌厌氧发酵合成ADO的过程中，DMB对丙酸杆菌菌体的毒害作用不是很明显，生物量也没有明显减少;但是过早加入诱导物DMB则情况相反，其会抑制合成中间体CBI，减少菌体量，降低维生素B12脱氧腺苷钴胺素最后的产量。

3）本研究为维生素B12发酵过程检验检测技术的开发提供了理论依据。在丙酸杆菌厌氧合成ADO的次级代谢途径中，DMB为何对CBI的合成有抑制作用有待今后作进一步的研究。

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