黔引迷迭香主要酚类成分分析及抗氧化活性比较

冷家归　于二汝　李德文　王少铭　罗莉斯　侯颖辉

摘 要 采用高效液相色谱法（HPLC）对4种黔引迷迭香的多酚成分进行定性和定量分析，并利用DPPH、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力（FRAP）3种方法评价多酚成分的抗氧化能力。结果显示4种材料均富含类黄酮、酚酸和二萜酚等多酚类化合物，总酚含量介于4 345.5～5 673.0 mg/100 g 。其中槲皮素、迷迭香酸、阿魏酸、绿原酸和鼠尾草酸是迷迭香最主要的酚类物质。黔引迷迭香4号的抗氧化活性最高，利用DPPH、ABTS和 FRAP等3种方法检测的结果依次为184.4、290.0、155.6 μmol/g。相关性分析表明，总酚与总抗氧化活性能力显著相关，迷迭香酸对总抗氧化活性能力贡献最大，其次为鼠尾草酸、槲皮素和水杨酸。本研究对于了解黔引迷迭香抗氧化活性成分，以及资源的进一步开发利用具有重要指导意义。

关键词 迷迭香；贵阳；多酚；HPLC；抗氧化活性

中图分类号 S573 文献标识码 A

Abstract Polyphenols in the leaves of four rosemary cultivars were extracted in alkyd mixture. The contents were identified and quantified using high performance liquid chromatography （HPLC）， and the antioxidant activities were evaluated using three different methods as DPPH， ABTS and FRAP assays. The results showed that the tested rosemarys were all abundant in polyphenols， such as flavonoid， phenolic acid and phenolic diterpenes. The contents of total phenolics in the four rosemarys were ranged from 4 345.5 to 5 673.0 mg/100 g. Among these phenols， quercetin， rosmarinic acid， ferulic acid， chlorogenic acid and carnosic acid were the main compounds. The results also showed that Qian 4 has the highest antioxidant activity， which was 184.4， 290.0 and 155.6 μmol/g determined by DPPH， ABTS and FRAP， respectively. Finally， correlation analysis indicated that rosmarinic acid made the largest contribution to the total antioxidant activity， while carnosic acid， quercetin and salicylic acid were the second greatest contributors. This study is valuable for understanding the compositions and further development and utilization of antioxidants in rosemary resources.

Keywords Rosmarinus officinalis L.； Guiyang； polyphenols； HPLC； antioxidant activities

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.025

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是唇形科迷迭香屬亚灌木，原产于地中海地区，目前世界各地广泛栽培，在我国贵州、云南、广西、海南、新疆和福建等地有一定种植面积。迷迭香植株中提取的非挥发性成分为多酚类物质，具有抗菌消炎等活性。植物多酚包括3种主要类型的化合物：类黄酮、酚酸和二萜酚[1]。类黄酮主要包括槲皮素、芫花素和杨梅素等，具有抗菌、消炎和抗氧化等功能，其中槲皮素可用于抗癌、消炎和抗氧化[2-3]，而且已在美国市场上作为主要膳食补充剂广泛使用[4]。酚酸类化合物具有抗病毒、抗菌、抗炎和抗氧化等生物活性[5-6]，主要包括迷迭香酸、水杨酸、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、对香豆酸和香草酸等成分。二萜酚包括鼠尾草酸和鼠尾草酚等，因其具有抗氧化和抗菌性，在食品、营养保健和化妆品行业的应用越来越多[7]。

多酚广泛存在于植物的茎、叶、皮、果内，是植物重要的次生代谢产物，不仅与植物病虫害及抗性有密切关系，也与人类生活息息相关。人们在食用粮食、蔬菜、水果及饮用茶过程中，都会摄入植物多酚，作为一类具有生物活性的天然化合物，多酚会对人的饮食、营养和健康产生影响。经常食用富含多酚食品可以提高血浆的抗氧化能力，保护细胞免受自由基氧化反应引起的氧化损伤，从而抑制多种氧化损伤引起的疾病[8-9]。因此，多酚是一类值得学者关注、研究和开发利用的天然化合物。研究表明，多酚对自由基的清除能力高于常用维生素C、维生素E和β-胡萝卜素等抗氧化活性物质，成为目前公认的体外强抗氧化剂[10-11]。Chipault等[12]就32种香辛料的抗氧化活性进行了研究，并认为迷迭香和鼠尾草是研究天然抗氧化活性的良好材料。

贵州省农业科学院香料研究所于2014年引进了4种迷迭香资源，依次命名为黔引迷迭香1号、2号、3号和4号，前期已对4种资源在贵阳生态区生长发育的主要特征特性及其精油含量与成分进行了分析[13]。本研究目的是明确4种黔引迷迭香叶片提取物中多酚组成与含量，并运用3种体外抗氧化活性法快速测定其抗氧化活性能力，为筛选天然抗氧化剂提供理论依据，以期开发天然抗氧化剂和食品添加剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 供试材料为黔引迷迭香1号、2号、3号、4号，均种植在贵州省农科院（26°N，106°E）贵阳试验地香料资源圃，且在相同栽培条件下正常生长2年。迷迭香叶片采集时间为2016年9月，选择天气晴朗的中午采集，每个品种随机取样5株。取样时，用枝剪从茎基部剪取整株，然后将样品带回实验室，随机采集100 g叶片，并立即冷冻干燥48 h直至恒重。干燥叶片加入液氮磨样机（IKA A11， 德国）研磨成均匀细粉，然后过60目筛，将粉末储存在棕色干燥器或–80 ℃冰箱中备用。

1.1.2 试剂 色谱级乙腈和甲醇购于赛默飞世尔（Thermo Fisher Scientific），分析纯甲醇和甲酸购买自北京化工厂，三氟乙酸（TFA，≥99%）、福林-肖卡试剂、没食子酸（GA）、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（Trolox）和芦丁（≥98%，PubChem CID： 5280805）购买自中国药品生物制品捡定所，水杨酸（≥99%，PubChem CID： 338）、咖啡酸（≥99%，PubChem CID： 689043）、绿原酸（≥99%，PubChem CID： 1794427）、阿魏酸（≥99%，PubChem CID： 445858）、对-香豆酸（≥99%，PubChem CID： 637542）、香草酸（≥97%，PubChem CID： 8468）、槲皮素（≥98%，PubChem CID： 5280343）、芫花素（≥99%，PubChem CID： 5281617）、杨梅素（≥98%，PubChem CID： 5281672）均购自上海安谱实验科技股份有限公司。1，1-二苯基-2-苦肼自由基（1，1-Diphenyl- 2-picrylhydrazyl radical，DPPH·+）、 2，2-联氮-双（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐自由基[2，2-azino-bis （3-ethylbenzothia- zoline-6-sulphonic acid） diammonium salt，ABTS·+]、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪（2，4，6-tripyridyl-S-triazine，TPTZ）、迷迭香酸（≥98%，PubChem CID： 5281792）、鼠尾草酸（≥97%，PubChem CID： 65126）和鼠尾草酚（≥98%，PubChem CID： 442009）均购自Sigma-Aldrich（St. Louis， USA）。高效液相色谱（HPLC）分析用水由Milli-Q超纯水系统（MA，美国）制备。

1.2 方法

1.2.1 总多酚的提取 总酚提取方法参考Zhang等[14]，有改动。称取0.1 g研磨好的迷迭香叶片干粉放入10 mL离心管中，加入2 mL抽提溶剂（甲醇：水：甲酸：三氟乙酸=70：27：2：1，体积比），用漩涡仪漩涡混匀，然后将盛有样品的离心管置于超声清洗器中，25 ℃超声辅助提取25 min， 12 000 rpm离心10 min，收集上清液，此过程重复3次，使样品充分抽提，合并收集到的上清液并混匀，加入石油醚，去除抽提液中的叶绿素及其他脂溶性杂质。将收集的抽提液存放于–20 ℃冰箱备用，样品进样之前过0.22 ?m有机滤膜。每个材料均做3次重复处理。

1.2.2 总酚含量测定 总酚含量分析参考Folin- Ciocalteu法[15]测定，有改动。取待测迷迭香叶片提取液100 ?L与0.9 mL超纯水依次加入10 mL试管中，补水5.0 mL，混匀，再加0.2 mL福林-肖卡试剂，充分摇匀，静置2 min后，加入10%碳酸钠溶液2.0 mL，混匀。让溶液在室温下避光反应60 min后，用移液枪分别移取200 ?L加入96孔酶标板，然后用酶标仪（MULTISKAN GO，Thermo，Fisher Scientific，美国）测量溶液在波长为750 nm处的吸光度。样品中总酚含量用没食子酸当量（GAE）表示，单位为mg/100 g干重。

1.2.3 HPLC分析 通过HPLC测定迷迭香叶片中多酚成分，参考Liu等[16]方法，稍有改动，并用标准品定性定量。该分析设备配备有P680A LPG-4型二元梯度泵，ultiMate 3000自动进样器，TCC-100色谱柱控温箱，戴安PDA-100二极管阵列检测器。色谱柱为C18反相硅胶柱（Athena C18-WP， 4.6 mm×250 mm， 粒径5 μm），保护柱为上海安谱科学仪器有限公司生产的C18反相保护柱。所用的流动相为：A相：0.1% 甲酸水溶液（v/v）；B相，乙腈。洗脱梯度为：0 min，30% B；2 min，30% B；16 min，60% B；31 min，90% B；33 min，30% B；35 min，30% B。每次进样10 μL，流速0.8 mL/min，柱温控制在25 ℃。鼠尾草酸和鼠尾草酚检测波长为280 nm，迷迭香酸、水杨酸、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、对香豆酸和香草酸检测波长为330 nm，槲皮素、芫花素和杨梅素检测波长为350 nm。使用二极管阵列检测器在线记录200～800 nm范围内的紫外-可见吸收数据。多酚化合物的含量以mg/100 g干重计。

通过标准品定性分析了多酚化合物，且逐一鉴定了其中的单个成分，并用外标法对其进行定量。每一个标准品都选取5个点作标准曲线，所有标准曲线都显示了较好的线性度（r2>0.998 9）。13个化合物的校准方程、线性范围（mg/L）、测定系数（r2）、检测限（LOD，mg/L）和定量限（LOQ，mg/L）、日间和日内相对标准偏差（RSD），具体如表1所示。其中日间和日内相对标准偏差分别小于3.09%（n=6）和2.78%（n=6）。樣品回收的相对标准偏差分别小于2.70%，回收率在96.58%～102.33%之间，表明该方法具有较高的准确性。

1.2.4 抗氧化活性测定 采用DPPH、ABTS和FRAP 3种方法来评价4种黔引迷迭香叶片提取的多酚总抗氧化能力。DPPH自由基清除能力的测定参照Brand-Williams等[17]方法并稍有改动。取50 μL叶片提取物加入到250 μL 0.5 mmol/L的DPPH溶液中暗反应24 h，然后在波长为515 nm处测量其吸光度，用没食子酸（GA）作标准曲线，标准曲线范围为100～600 μmol/L。结果用GA当量表示，即μmol GAE/g。ABTS自由基清除能力的测定参照Zheng等[18]方法并稍作改动。取5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液，加入88 μL 140 mmol/L的硫酸钾溶液，轻轻混匀，在室温下暗反应14 h。用PBS缓冲液将ABTS·+溶液稀释，将5 μL样品加入到995 μL稀释后的ABTS·+溶液中，在室温下暗反应10 min，然后在波长为732 nm处测量其吸光度。用Trolox作标准曲线，标准曲线范围为100～900 μmol/L。结果用Trolox当量表示，即μmol TE/g。根据Benzie等[19]所述的方法进行FRAP测定，有改动。将25 mL pH 3.6的醋酸盐缓冲液，2.5 mL 10 mmol/L TPTZ溶液和2.5 mL 20 mmol/L的Fe3+溶液三者混合，配制成FRAP工作液。将5 μL待测样品加入到995 μL FRAP工作液中，室温下暗反应15 min，然后在波长为593 nm处测量其吸光度。用Trolox作标准曲线，标准曲线范围为150～1 200 μmol/L。结果用Trolox当量表示，即μmol TE/g。

1.3 数据分析

所有数据均为3个生物学重复，且用平均值（M）±标准差（SD）表示。数据统计与分析采用SPSS 19.0软件完成。采用单因素方差分析和Duncan多重比较来确定不同组平均值在p<0.05水平上的显著相关性，Pearson（双侧）相关检测来确定抗氧化活性和多酚成分之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 总酚含量

为了评价4种黔引迷迭香的抗氧化活性能力，分别测定了叶片提取物中总酚含量，结果见表2。4种迷迭香的总酚含量在4 345.5～5 673.0 mg/100 g之间。其中，黔引迷迭香1号的总酚含量最高；其次是黔引迷迭香4号，为（5 646.4±85.5） mg/100 g，黔引迷迭香3号为（5 537.0±84.2） mg/100 g，以黔引迷迭香2号的总酚含量最低。Sánchez- Vioque等[20]研究结果表明，利用超声辅助有机溶剂提取迷迭香叶片中的总酚含量为4 400.0 mg/100 g。由此可见，在贵阳生态区生长的黔引迷迭香1号、3号和4号资源的总酚含量相对较高。

2.2 类黄酮含量

用标准品定量了槲皮素、芫花素和杨梅素3种类黄酮，其相对含量见表2。在4种黔引迷迭香中，槲皮素含量介于92.0～154.5 mg/100 g之间。其中，黔引迷迭香4号的槲皮素含量最高，其次是黔引迷迭香3号，黔引迷迭香2号的槲皮素含量最低。芫花素的含量在1.6～48.4 mg/100 g之间，以黔引迷迭香2号含量最高，其次是黔引迷迭香3号，以黔引迷迭香1号的芫花素含量最低。杨梅素含量介于14.6～48.9 mg/100 g之间，以黔引迷迭香4号的含量最高，黔引迷迭香2号的含量最低。故槲皮素是主要的类黄酮。

2.3 酚酸含量

本文研究的酚酸包含迷迭香酸、水杨酸、咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、对香豆酸和香草酸共7种，其中迷迭香酸、阿魏酸和绿原酸是主要的酚酸，其相对含量见表2。迷迭香酸在4种资源中含量在349.4～515.3 mg/100 g之间，以黔引迷迭香4号的含量最高，黔引迷迭香2号的含量最低。水杨酸含量介于55.6～87.3 mg/100 g之间，黔引迷迭香3号的含量最高，黔引迷迭香2号的含量最低。咖啡酸含量介于21.4～48.3 mg/100 g之间，绿

原酸含量介于104.5～156.2 mg/100 g之间。对香豆酸在4种材料中的含量介于21.2～49.0 mg/100 g之间，黔引迷迭香1号的含量最高，黔引迷迭香2号的含量最低。香草酸含量为37.0～146.7 mg/100 g之间，黔引迷迭香1号的含量最高，其后依次是黔引迷迭香2号、4号和3号。而阿魏酸在4种黔引迷迭香中的含量介于287.9～437.5 mg/100 g之间，其中黔引1号最高，黔引2号最低。由此可知，黔引迷迭香1号的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸和香草酸含量均最高。

2.4 二萜酚含量

本文鉴定了鼠尾草酸和鼠尾草酚，均是含量较高的二萜酚，其相对含量见表2，这与文献报道的从新鲜迷迭香中提取的含量相近，且均是重要的二萜酚[5]。鼠尾草酸含量在904.9～1 639.3 mg/ 100 g 之间，其中黔引迷迭香4号含量最高，其次是黔引迷迭香3号[（1 391.9±56.1） mg/100 g]，黔引迷迭香2号的含量最低。鼠尾草酚含量在62.2～166.4 mg/100 g之间，以黔引迷迭香1号含量最高，黔引迷迭香4號的含量最低。故鼠尾草酸和鼠尾草酚均是主要的二萜酚类化合物。

2.5 抗氧化活性能力

DPPH、ABTS和FRAP法是评价抗氧化剂的抗氧化能力常用方法，3种方法的作用机理各不相同且各具优缺点，目前国内外还没有统一的标准[17-19]。因此，本研究同时用以上3种方法来评价4种黔引迷迭香的抗氧化能力，结果如表3所示。3种方法测定结果均表明黔引迷迭香4号的抗氧化能力最强，黔引迷迭香2号的抗氧化能力最弱，上述3种方法所测得的迷迭香抗氧化能 力在数值上有一定区别，可以运用于快速检测 体外抗氧化活性能力。4种迷迭香的DPPH自 由基清除能力在（142.3±2.0）～（184.4±1.0） μmol/g之间，其强弱依次为黔引迷迭香 4号、3号、1号和2号。ABTS自由基清除能力在（257.0±0.6） ～（290.0±0.5） μmol/g之间，其强弱依次为黔引迷迭香4号、1号、3号和2号。FRAP抗氧化活性能力在（112.3±6.5）～（155.6±6.6） μmol/g之间，其强弱依次为黔引迷迭香4号、3号、1号和2号。这说明黔引迷迭香4号、1号和3号具有较高的抗氧化活性能力，可作为研究天然抗氧化活性的资源材料。

2.6 多酚成分和抗氧化活性的相关性分析

本研究将3种抗氧化活性方法所得数值与总酚、3种类黄酮、7种酚酸和2种二萜酚的含量分别作相关性分析，结果见表4。总酚与DPPH（p < 0.05，r = 0.928）、ABTS（p < 0.05，r = 0.945）和FRAP（p < 0.05，r = 0.949）均为p<0.05水平上显著相关。

在类黄酮类成分中，槲皮素与DPPH（p < 0.05，r = 0.930）、ABTS（p < 0.05，r = 0.903）和FRAP（p < 0.05，r = 0.909）均为p<0.05水平上显著相关。而芫花素和杨梅素与DPPH、ABTS和FRAP均无相关性。研究结果表明，槲皮素对迷迭香抗氧化能力的贡献较高，故槲皮素是迷迭香叶片提取物中的活性较强多酚成分。

酚酸类成分中，迷迭香酸是主要的抗氧化活性成分之一[6]，水杨酸多见于植物防御机制的研究[21]。迷迭香酸与DPPH（p <0.01，r = 0.983）和FRAP（p <0.01，r = 0.990）为p<0.01水平上的极显著相关，和ABTS（p <0.05，r = 0.970）为p<0.05水平上的显著相关。水杨酸与DPPH（p < 0.05，r = 0.947）、ABTS（p < 0.05，r = 0.937）和FRAP（p < 0.05，r = 0.978）均为p <0.05水平上显著相关。咖啡酸、绿原酸、阿魏酸、对香豆酸和香草酸与DPPH、ABTS和FRAP均无相关性。研究结果表明，迷迭香酸和水杨酸对迷迭香抗氧化活性的贡献较高，故均是抗氧化活性较强的多酚成分。

在二萜酚类成分中，鼠尾草酸与DPPH（p < 0.05，r = 0.942）、ABTS（p < 0.05，r = 0.916）和FRAP（p < 0.05，r = 0.930）均为p<0.05水平上显著相关。鼠尾草酸是迷迭香提取物中丰富的多酚成分，且是主要的抗氧化活性成分，这与本文结果一致[7]。表4中鼠尾草酚与DPPH、ABTS和FRAP均无相关性，与前人研究不一致，可能是鼠尾草酸在一定条件下会转化成鼠尾草酚所致[22]。

综上可知，总酚对总抗氧化活性能力的贡献较大，而迷迭香酸是总酚中对总抗氧化活性能力贡献最大的成分，其次是鼠尾草酸、槲皮素和水杨酸。

3 讨论

本文定性定量分析了在贵州贵阳生态区生长的4种黔引迷迭香中多酚的成分。结果表明，4种黔引迷迭香都含有丰富的多酚成分。其中槲皮素是典型的黄酮醇型类黄酮，还是植物中主要的抗氧化活性成分，也是极好的体外抗氧化剂，更是类黄酮家族中活性氧最有效的清除剂[2-3]，槲皮素的抗氧化能力源于分子内存在两个具有清除自由基能力的基团，即B环中的邻苯二酚酚基团和AC环3位的OH基团[23]；槲皮素常见于欧洲越橘（15.8 mg/100 g）、蔓越橘（8.3～14.0 mg/100 g）、沙棘果（6.2 mg/100 g）、番茄（0.5 mg/100 g）、洋葱（22.6 mg/100 g）、生菜（2.0 mg/100 g）、芹菜（3.5 mg/100 g）和西兰花（2.8 mg/100 g）等水果和蔬菜中[24-25]，说明迷迭香中槲皮素的含量均高于蔬菜和水果。而杨梅素在蔓越莓、黑醋栗、岩高兰、欧洲越橘、蓝莓和覆盆子中的含量介于1.4～14.2 mg/100 g之间[25]，可见黔引迷迭香中的杨梅素含量较高；此外，杨梅素还是天然的类黄酮，具有抗癌和抗诱变剂等生物活性，在自然界植物中广泛存在[26]。

迷迭香酸、阿魏酸和绿原酸均是重要的酚酸，同前人研究结果一致[5， 27]。迷迭香酸在紫草科和唇形科植物中存在，主要具有抗病毒、抗菌、抗炎和抗氧化等生物活性[6]。阿魏酸是当归（Angelica sinensis）、大三叶升麻（Cimicifuga heracleifolia）和川穹（Lignsticum chuangxiong）等中药植物中普遍存在的酚酸，具有低毒、容易在人体内吸收等特点，还具有抗菌、消炎、抗血栓形成和抗癌活性，并广泛应用于食品和化妆品行业[28]。绿原酸在迷迭香、枸杞、咖啡、苹果、梨、浆果和茄子等植物中存在，主要功能是体外抗氧化剂和预防心血管疾病[29-30]。

鼠尾草酸是主要的二萜酚，早在70年前首次从鼠尾草中提取鼠尾草酸，并在50年前对其进行了鉴定，因其具有抗氧化和抗菌性，在食品、营养保健和化妆品行业的应用越来越多[7]；鼠尾草酸在迷迭香、鼠尾草、罗勒、香蜂花、神香草和牛至等唇形科植物中广泛存在，其含量在1.0～ 218.0 mg/100 g之间[7]，而在迷迭香中为30.0～500.0 mg/100 g之间，且在‘Severn Sea和‘Miss Jessopps Upright中含量较高[31]。Okamura等[32]报道鼠尾草酚含量为387.0 mg/100 g，毛萼迷迭香中的鼠尾草酚含量为（2 977.0±46.5） mg/100 g，且具有抗癌和消炎活性[5]。此結果表明，在贵阳生态区生长的4种黔引迷迭香的鼠尾草酸含量偏高，而鼠尾草酚含量偏低。

通过DPPH、ABTS和FRAP三种不同的抗氧化活性评价方法，评估了4种黔引迷迭香提取物中多酚的抗氧化活性能力。黔引迷迭香4号、黔引迷迭香1号和黔引迷迭香3号具有相对较高的总抗氧化活性能力，可作为食品添加剂或防腐剂的天然原材料。研究结果表明，主要的类黄酮、酚酸和二萜酚等成分对抗氧化活性有不同的贡献。在本研究中，迷迭香酸、鼠尾草酸、槲皮素和水杨酸对抗氧化活性有较显著的影响。其中迷迭香酸对总抗氧化活性能力的贡献最大，然后依次是鼠尾草酸和槲皮素，与前人研究结果一致[6-7， 33]。这进一步证明了迷迭香酸和鼠尾草酸是迷迭香叶片提取物中主要的多酚化合物。与此同时，本文中水杨酸是对总抗氧化活性能力有较大贡献的酚酸类成分，而前人相关研究表明，水杨酸在植物病虫害防御中发挥重要作用[21， 27]。此外，Kerio等[34]研究表明，多酚化合物含量越高，则其抗氧化活性能力相对越强，这与本文研究结果一致。因此，本研究结论对于深入了解迷迭香抗氧化活性成分和资源的开发利用具有重要指导意义。

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