文心兰生物钟相关基因PRR7克隆与表达分析

杨翠萍　胡进　闫冰玉　巩笑笑　谭玉荣　高璇　王丹　张恒　刘进平

摘 要 利用转录组文库中的PRR7基因序列，从文心兰盛开期花瓣中扩增得到文心兰PRR7基因的2个成员，分别命名为OnPRR7-1（GenBank登录号：MG543993）和OnPRR7-2（GenBank登录号：MG543994）。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因全长分别为2 091 bp和2 154 bp，分别编码696和717个氨基酸大小的蛋白质序列。蛋白质二级结构分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2均为疏水性蛋白。BlastX比对和系统发育分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因和铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的PRR基因同源性比较高。实时荧光定量PCR分析结果表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因均呈现昼夜节律性表达格式，并且在正午12点时表达量达到峰值；在花发育和衰老过程中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在花瓣中的表达量均在绽口期和衰老初期达到峰值，表明其有可能在花发育的开花和花衰老的过程中发挥作用。

关键词 文心兰；生物钟；PRR7基因；表达分析；开花；花衰老

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract Two members of Oncidium PRR7 gene family， OnPRR7-1 and OnPRR7-2， were isolated from the petals of the full-opened flowers based on the predicted PRR7 gene sequence through transcriptome analysis. The full-length of OnPRR7-1 and OnPRR7-2 was 2 091 bp and 2 154 bp in length， encoding peptides with 696 and 717 amino acids， respectively. Secondary structure modeling showed that these proteins were hydrophobic. BLASTX alignment and phylogenetic analysis showed that the OnPRR7-1 and OnPRR7-2 had high homology with the the counterparts of Dendrobium officinale and Phalaenopsis equestris. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that OnPRR7-1 and OnPRR7-2 genes both had a circadian expression pattern， with the expression levels peaked at 12：00 within 24 hours. During the flower development and senescence， the expression levels of OnPRR7-1 and OnPRR7-2 in petals reached the peak at the bud burst stage and the initial stage of senescence， suggesting that they play a role in flowering and flower senescence in Oncidium.

Keywords Oncidium； circadian clock； PRR7 gene； expression analysis； flowering； flower senescence

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.015

生物鐘（circadian clock）是生物体内一种内在计时机制，是生物体对地球光照和温度等环境因子昼夜周期变化长期适应而演化产生的适应机制[1-4]。在植物体中，可以使体内生物学过程与体

外的昼夜和季节条件变化同步化，从而调控新陈代谢活动并在最有利的昼夜和季节时间来分配资源[5]。生物钟对于植物的生长、发育、生殖和胁迫反应都有调控作用[1-5]。在生物钟系统核心为一套复杂的、环环相扣的转录和翻译反馈环路组成。生物钟核心振荡器由3个循环组成：中心循环、早晨循环、傍晚循环[2]。其中PRRs（pseudo- response regulators）为植物转录/翻译昼夜节律网络中的关键成分，在生物钟系统中的中央振荡器和生物钟输出过程起着至关重要的调控作用[6]。

目前拟南芥中发现参与生物钟调控的PRRs共有5个，分别是PRR1/TOC1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9[1-2]。拟南芥中PRR家族成员在一天里表达峰值按照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1的顺序依次出现，间隔2～3 h。其中PRR9出现在黎明，而PRR1表达峰值出现在傍晚[7]。这5个成员因为与原核生物的磷酸化和脱磷酸化双元信号系统的受体RR（response regulator）有很高的同源性而被命名为PRRs家族。PRRs基因均具有两个保守的结构域，分别是氨基端的RLD（receiver-like domain）结构域和羧基端CCT（CONSTANS/CONSTANS-LIKE/TOC1）结构域[8-10]。目前，除在模式植物拟南芥和水稻中PRR基因研究较为充分外，在少数重要作物如玉米、高粱、大麦、小麦和甜菜等也有少数的研究，但尚未见到在观赏园艺植物上相关基因研究的报道[11]。

对于PRR7基因的研究不多，但是先前有研究表明 PRR7-β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白定位于细胞核，意味着其可能在调控光敏基因表达中起作用，并经研究发现PRR7可作为光敏色素调节的基因表达中信号传导的中间体，负责响应于光的幼苗的消长和生物钟的阶段[12]。拟南芥的生物钟是由一系列的互锁反馈循环环组成，PRR7和PRR9在早上循环环中起作用；经prr7/prr9双突变体研究发现，PRR7和PRR9在调节CCA1和LHY响应环境温度的活动中发挥作用[13]。

文心兰（Oncidium）属于兰科文心兰属植物，又名舞女兰、金蝶兰等，是世界上重要的切花品种，具有极其重要的观赏价值和经济价值[14-15]。栽培的文心兰切花品种以黄色花南茜种（Oncidium Gower Ramsey）及其变异种为主[14-15]。海南大学热带农林学院刘进平课题组研究表明，文心兰花发育可根据其形态特征明确分期，是一种很好的花发育和衰老的研究系统[16-18]。此前刘进平课题组已从文心兰中克隆和鉴定出一系列跟花发育和衰老相关的基因[19-23]。植物能精确地控制其开花时间，以确保其能成功地进行繁殖。开花时间的季节控制的一个重要因素是光周期，而日照时长由体内生物钟所测量的。因此，生物钟对光周期反应和植物开花具有重要的调控作用[24-25]。我们最近的转录组学研究表明，生物钟基因PRR7基因可能还参与了花瓣衰老的启动调控。

本研究利用转录组分析所获得的序列，克隆到生物钟相关基因PRR7，并利用生物信息学方法分析了该基因推定的蛋白质的结构，利用序列比对构建了系统进化树，并研究了PRR7基因昼夜节律性表达及在文心兰切花发育和衰老过程中在花瓣中的基因表达格式。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料为文心兰南茜种‘黄金3 代（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold 3）鲜切花。购自海南出入境检验检疫局热带植物隔离检疫中心。

1.2 方法

1.2.1 文心兰花瓣总RNA的提取及cDNA第一链的合成 取2～3个文心兰花瓣于预冷的研钵中，在液氮环境下充分研磨成粉末状，之后用通用植物总RNA提取试剂盒（离心柱型，购自北京百泰克生物技术有限公司）提取RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，并且测量RNA的浓度。获得高质量RNA后，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試剂盒（购自TaKaRa公司）说明进行反转录反应，合成cDNA第一链。

1.2.2 文心兰PRR7基因的克隆 利用转录组测序得到的差异表达基因PRR7序列片段，用NCBI的Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.

gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行保守结构域分析，然后用NCBI的ORFfinder（https：//www.ncbi. nlm. nih.gov/orffinder/）分析序列的开放阅读框，并根据ORF两端设计上下游引物PRR7-F和PRR7-R（表1），克隆PRR7基因的ORF序列。PCR反应体系如下：TaKaRa LA Taq 0.5 ?L，10× LA Taq Buffer 5 ?L，dNTPs 8 ?L，cDNA 1 ?L，上下游引物各0.5 ?L，灭菌蒸馏水 34.5 ?L。PCR程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 15 s，30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。将PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用OMEGA Gel Extraction Kit（购自TaKaRa公司）进行胶回收，回收目的片段，之后连接到pMD-19T载体上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，过夜培养，进行菌落PCR鉴定，获得阳性克隆后送上海英潍捷基生物公司进行测序。

1.2.3 PRR7-1和PRR7-2基因生物信息学分析 利用NCBI的ORFfinder进行ORF和编码氨基酸序列预测；用ExPASy在线分析软件（https：//www.expasy.org/vg/index/Protein）进行蛋白质理化性质的预测，包括蛋白质等电点和相对分子质量和蛋白质二级结构预测（SOPMA & CoILS），用Swiss-model（https：//swissmodel. expasy.org）预测蛋白质的三级结构，使用TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）进行跨膜预测，使用DNAMAN软件进行氨基酸序列的多重比对，并且使用MEGA 6.0软件构建NJ系统进化树。

1.2.4 文心兰PRR7基因的节律性表达分析以及在花发育过程中的表达分析 文心兰PRR7基因的节律性表达分析取样方法为：首先将购买的100枝文心兰鲜切花在12 h光照和12 h黑暗（12L：12D），预处理2～3 d，然后每隔2 h采样，总共采样时间48 h；文心兰PRR7基因在花发育过程中的表达分析取样方法为早上8点采集分别处于花苞期、绽口期、半开放期、盛开前期、盛开期、衰老初期、衰老期和脱落干枯期8个阶段的文心兰花瓣。采用1.2.1节中的方法进行花瓣总RNA的提取和反转录反应。用Actin检测基因对反转录得到的cDNA进行质量的检测，Actin基因作为内参。所用引物序列见表1。Q-PCR表达分析的反应体系如下：SYBR Primix TaqTM 10 ?L，cDNA模板 2 ?L，ddH2O 6.6 ?L，DyeII 0.4 ?L，上下游引物各0.5 ?L。每个不同来源的模板都进行3次生物学重复实验。PCR程序如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40个循环。最后采用2–ΔΔCt法进行目的基因的表达量分析。

1.2.5 文心兰PRR7-1和PRR7-2基因差异验证 考虑到两个基因仅存在60 bp左右碱基的明显差异，所以Q-PCR对这两个基因进行区分验证时采用相同的下游引物PRR7-R-Q，而上游引物PRR7-1-F-Q是在差异序列之前区域设计的引物，上游引物PRR7-2-F-Q则是在差异序列区域设计的引物；以PRR7-1和PRR7-2为模板，以Q-PCR设计的引物PRR7-1-F-Q和PRR7-R-Q，及PRR7-2-F-Q和PRR7-R-Q为引物分别进行PCR扩增反应，观察扩增产物的异同。

2 结果与分析

2.1 文心兰PRR7基因cDNA的克隆

以文心兰花盛开前期的花瓣RNA反转录产生的cDNA为模板，PCR扩增得到两条2 000 bp左右的条带（图1），分别命名为OnPRR7-1（GenBank登录号：MG543993）和OnPRR7-2（GenBank登录号：MG543994）。

2.2 文心兰OnPRR7-1和OnPRR7-2差异序列验证

OnPRR7-2序列中间部分有60 bp左右的序列与OnPRR7-1序列差异比较大，因此使用设计的Q-PCR引物OnPRR7-1-F-Q与OnPRR7-R-Q，及OnPRR7-2-F-Q与OnPRR7-R-Q对2个基因进行验证.其中OnPRR7-2-F-Q引物是根据差异序列设计的引物，扩增结果如图2所示。图2中泳道1为以OnPRR7-1为模板，以OnPRR7-2-F-Q和OnPRR7-R-Q为引物的扩增结果；泳道2为以

OnPRR7-1为模板，以OnPRR7-1-F-Q和OnPRR7- R-Q为引物的扩增产物，产物大小76 bp；泳道3为以OnPRR7-2为模板，以OnPRR7-2-F和OnPRR7-R为引物的扩增产物，产物大小89 bp；泳道4為以OnPRR7-2为模板，以OnPRR7-1-F-Q和OnPRR7-R-Q为引物的扩增产物，产物大小为118 bp。结果表明OnPRR7-1和OnPRR7-2相似性很高但是也存在差异，说明是2个不同的序列。

2.3 文心兰OnPRR7-1和OnPRR7-2基因的生物信息学分析

测序表明OnPRR7-1和OnPRR7-2存在很小的差异，其中OnPRR7-2比OnPRR7-1多60 bp左右的核苷酸序列。理化性质分析表明，OnPRR7-1编码的蛋白分子式为C3246H5190N1010O1064S28，分子量76 286.72，等电点是7.92，经预测该蛋白是一种不稳定蛋白。在氨基酸组成上是负电荷残基（Asp+Glu）总数为80个，正电荷残基（Arg+Lys）总数为82个。OnPRR7-1蛋白是一种亲水性蛋白，经跨膜结构域预测可知，OnPRR7-1蛋白没有明显的跨膜结构域，因此它可能不是膜蛋白。OnPRR7-2编码的蛋白分子式为C3338H5341N1039O1098S27，分子量为78 462.05，等电点是8.13，经预测该蛋白也是一种不稳定的蛋白。在氨基酸组成上，负电荷残基（Asp+Glu）总数为81个，正电荷残基（Arg+Lys）总数为84个，OnPRR7-2同样也是一种疏水性蛋白。经跨膜结构域预测，该蛋白同样没有明显的跨膜结构，因此也不是膜蛋白。测序结果显示，OnPRR7-1和OnPRR7-2的cDNA片段分别为2 091 bp和2 154 bp。以NCBI上的ORF开放阅读框在线分析可知，OnPRR7-1和OnPRR7-2分别编码696个氨基酸（图3）和717个氨基酸（图4）。

经二级结构预测可知，OnPRR7-1编码的蛋白二级结构主要包含28.30% α螺旋，16.95% β片层，47.13%无规则卷曲；OnPRR7-2编码的蛋白主要包含27.34% α螺旋，17.29% β片层，46.86%无规则卷曲；其中均是以无规则卷曲含量最多。用Swiss-model分析OnPRR7-1的三级结构（图5）和OnPRR7-2蛋白的三级结构（图6），结果显示2个基因表达的蛋白均与一种趋化蛋白CheY有25%左右的相似性，相似度并不高。

用DNAMAN将OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白的氨基酸序列与其他9个物种的PRR7蛋白氨基酸序列进行同源序列比对，比对结果如图7所示。其他9个物种的蛋白分别是：海枣PRR37（Phoenix dactylifera，XP_008789022.1）、菡萏PRR37（Nelumbo nucifera，XP_010253458.1）、葡萄PRR37（Vitis vinifera，XP_010658157.1）、油棕PRR37（Elaeis guineensis，XP_010920961.1）、蓖麻PRR37（Ricinus communis，XP_01557-838?0.1）、凤梨PRR37（Ananas comosus，XP_020?10???8?3???7???8.1）、巴旦木APRR7（Prunus persica，XP_0?20?4?2??3049.1）、小兰屿蝴蝶兰PRR73（Phalaenopsis e?q????ue?stris，XP_020600189.1）和铁皮石斛PRR73（D?e?n??drob??ium catenatum，XP_020692445.1）。比对结果显示，分析的10个物种的氨基酸序列均在N末端有非常保守的RLD结构域，C末端有非常保守的CCT结构域。

2.4 OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白系统进化分析

为研究OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白的进化关系，用MEGA 6.0软件将OnPRR7-1和OnPRR7-2

及其同源的其他植物的PRR调控因子构建系统发育树（图8）。共同构建系统发育树的其他PRR调控因子分别是：巴旦木APRR7（Prunus? persica XP_020423049.1）、花生APRR7（Arachis ??????ipaensis XP_016183324.1）、苦瓜APRR7（Momordica charantia XP_022143922.1）、榴莲APRR7（Durio zibethinus XP_022745742.1）、菡萏PRR3/7（Nelumbo nucifera XP_01025345?8.1）、桑树PRR（Morus notabilis XP_01011231?8.1）??、番茄PRR3/7（Solanum lycopersicum XP_0??04237??533.1）、葡萄PRR3/7（Vitis vinifera XP_010658157.1）、蓖麻PRR3/7（Ricinus communis XP_015578380.1）、枣PRR3/7（Ziziphus jujuba XP_015877113.1）、大桉PRR3/7（Eucalyptus grandis XP_010067243.1）、可可子PRR3/7（Theobroma ?cacao XP_007009669.2）、铁皮石斛PRR7/3（Dendrobium catenatum XP_0206924?45.1）、小兰屿蝴蝶兰PRR7/3（Phalaenopsis equestris XP_02060?0189.1）、野生稻PRR7/3（Oryza brachyantha XP_00?664???9884.1）、玉米 PRR7/3（Zeas ACG24234.1）、凤梨PRR3/7（Ananas comosus XP_020108378.1）、石刁柏PRR7/3（As?par?agus officinalis XP_020271482.1）、茳芏PR?R7/3?（Musa acuminata subsp.malaccensis XP_0?09??3865?43.1）、海枣PRR3/7（Phoenix dactylifera XP_008789022.1）、油棕PRR3/7（Elaeis guineensis XP_010920961.1）、拟南芥PRRs（Ara?bid?op??sis thaliana AED97278.1、AED90520.1、AEC10754.1、BAB13743.1、OAO90?757.1）水稻PRRs（Oryza sativa Indica BAD388?59.1、BAD388?58.1；Oryza sativa Japonica BAD?38856.1、BA?D?388?55.1）、小立碗藓（Physcomitrella patens BAJ83829.1、BAJ83828.1、BAJ83827.1、BAJ83826.1、BAI39993.1）、铁皮石斛PRR1（Dendrobium catenatum PKU76118.1）、深圳拟兰（Apostasia shenzhenica PKA66208.1）和作为外族的巴西安白僵菌PRR1（Beauveria bassiana PMB67668.1）。分析结果表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2与同为兰科植物的铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的PRR7/3亲缘关系最近，并且系统发育树的分支表明，双子叶植物纲和单子叶植物纲的PRR蛋白分别分支成了上下两组。

2.5 OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表达分析

通过Q-PCR可知，在连续的12L：12D处理下的48 h中OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表达变化情况如图9所示。分析可知，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在2个连续的周期内呈现节律性表达，在12L：12D条件下，2个基因的表达峰值出现在光照后的4 h（上午10：00），谷值出现在光照前的4 h（凌晨2：00）左右。

在文心兰花发育的8个时期（花苞期A、绽口期B、半开放期C、盛开前期D、盛开期E、衰老初期F、衰老期G和脱落干枯期H）中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表达情况如图10所示。该基因在绽口期（B）和衰老初期（F）时期表达量达到高峰值，而在盛开前期（D）和脱落干枯期（H）表达达到低峰值。

3 讨论

本研究克隆得到2个文心兰PRR7基因：OnPRR7-1和OnPRR7-2基因，这2个PRR7基因成员的核苷酸序列仅有60 bp左右差异。序列比对表明它们与其他物种PRR基因氨基酸序列均在N端或C端有非常保守的RLD和CCT结构域。文心兰PRR7基因存在2个成员的现象和小立碗藓及水稻情况类似。小立碗藓PRR7存在编码不同的氨基酸序列的两个成员PRR7a和PRR7b[26]，水稻粳稻和籼稻中也具有序列不同的两基因成员PRR73和PRR37 [27]，但拟南芥中只有一个PRR7基因，这可能是由于在进化过程中基因含量和序列发生变化所致。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因含有RLD和CCT保守结构域的氨基酸序列，这与其他物种的PRRs家族基因编码的氨基酸序列保守结构域相一致，但中间序列则差异较大。PRRs被定义为是包含有2个保守域的蛋白质，这2个结构域被1个不太保守的“可变”域分隔[8， 28]。因此，本研究克隆的2个文心兰基因属于PRR基因家族。发育树的分支表明，双子叶植物纲和单子叶植物纲的PRR蛋白分别形成亲缘关系较远的两组，而OnPRR7-1和OnPRR7-2与同为兰科植物的铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的PRR7/3亲缘关系最近。显然文心兰PRR基因在进化上也与其他物种的同族基因一样具有保守性[29-30]。

表达分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在文心兰花瓣中呈现连续的昼夜循环表达。在12L：12D光照黑暗循环处理下，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因呈现节律性表达，和之前研究的拟南芥和菁芜菁PRRs基因的表达模式相一致[31-32]。拟南芥PRR7与PRR9和PRR5通过对CCA1和LHY启动子的阻遏活性而在生物钟反馈环路中发挥功能[7]，PRR7本身也通过转录和转录后机制而受到调控[33]。有研究表明拟南芥PRR7与PRR9和PRR5一起通过CONSTANS依赖性途径控制开花时间[34]。本研究中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在文心兰花发育和花衰老过程中呈现双峰表达模式，表达量分别在绽口期（B）和衰老初期（F）达到高峰值，而在两峰之间的盛开前期（D）处于低峰。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因這种表达模式，表明它们有可能在花发育的开花和花衰老的过程中发挥作用，但仍待进一步证实。

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