等效面法分析3种氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的联合作用

2018-05-14 14:44葛会林陶珊珊智霞袁宏球苏冰霞马晨
热带作物学报 2018年4期
关键词:混合物组分射线

葛会林 陶珊珊 智霞 袁宏球 苏冰霞 马晨

摘 要 为了更好地评估与预测三元混合物的毒性相互作用,以3种氨基甲酸酯类农药残杀威、灭多威、速灭威为研究对象,应用均分等效面设计(EESD)法配制三元混合物,应用直接均分射线设计法(EquRay)配制两两混合的二元混合物,测定混合物对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制效应,基于三角形的3次插值方法构建三元混合物在20%、50%、80%效应的等效面,以浓度加和(CA)与独立作用(IA)为参考模型分析混合物的毒性相互作用。结果表明,Weibull函数能良好地拟合3种氨基甲酸酯类农药及其混合物对AChE的浓度-效应数据(R2>0.99,RMSE<0.03)。基于等效面分析,残杀威、灭多威、速灭威的三元及二元混合物毒性符合CA模型,呈现加和作用,而IA轻微高估了混合物的毒性。共毒系数法也证实这3种氨基甲酸酯类农药呈现加和作用。回归分析发现三元混合物毒性(pECx)与速灭威的浓度分数具有良好的负相关关系。均分等效面设计法与等效面分析法可用于有效评估三元混合物的联合毒性。

关键词 均分等效面设计法;等效面;氨基甲酸酯类农药;乙酰胆碱酯酶;浓度加和;独立作用;加和作用;共毒系数法

中图分类号 X171.5 文献标识码 A

Abstract In order to better assess and predict the combined toxicity of ternary mixture, three carbamate pesticides including propoxur, methomyl and metolcarb were selected as mixture components. The equipartition equivalent-surface design (EESD) method was used to design ternary mixtures, and the direct equipartition ray design (EquRay) was used to design binary mixtures. The toxicities of these mixtures inhibiting acetylcholinesterase were determined using the microplate toxicity analysis method. The equivalent-surfaces at 20%, 50% and 80% effects were constructed based on the triangle-based cubic interpolation method. The concentration addition (CA) and independent action (IA) as the additive reference models were used to analyze the toxic interaction. The results showed that the Weibull function fit well the concentration-response data of the three pesticides and their mixtures with R2>0.99 and RMSE<0.03. Based on the equivalent-surface analysis, the toxicities of ternary and binary mixtures of propoxur, methomyl, and metolcarb conformed to the CA prediction, showing an additive effect, while the IA prediction slightly overestimated the mixture toxicity. The method of co-toxicity coefficient also confirmed this additive effect of propoxur, methomyl, and metolcarb. Meanwhile, it was found that there was a good negative correlation between the ternary mixture toxicity (pECx) and the concentration proportion of metolcarb. The equipartition equivalent-surface design method and equivalent-surface analysis method could be effectively used to analyze the joint toxicity of ternary mixture.

Key words equipartition equivalent-surface design method; equivalent-surface; carbamate pesticides; acetylcholinesterase; concentration addition; independent action; additive effect; co-toxicity coefficient

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.033

氨基甲酸酯類农药(carbamate pesticides,CBPs)是一种广谱杀虫、杀螨、除草剂,具有选择性强、高效、对人畜和鱼类低毒等特点[1],多以混剂广泛应用于农林牧业[2],但对生态环境尤其是水环境造成的污染与影响日益严重[3]。CBPs多与有机磷类和菊酯类药剂混用,如灭多威和辛硫磷混用防治棉铃虫,异丙威和氯氰菊酯混用防治十字花科蔬菜蚜虫[4],少数有三元或多元混剂,同类CBPs药剂之间混用的研究及应用较少。

实际环境中因农药混用所残留的低剂量混合污染物导致的累积毒性与相互作用(加和、协同及拮抗)已引起人们广泛关注[5],一般使用酶[6]、细胞[7]、细菌、藻类[8]、鱼[9]、鼠等来表征污染物及其混合物的毒性。如孙金秀等[10]研究表明灭多威与辛硫磷、速灭威与甲胺磷以等毒性剂量混配对大鼠急性经口毒性为加和作用,而灭多威与甲基对硫磷为拮抗作用,异丙威与马拉硫磷为协同作用。张瑾等[11]应用均匀设计射线法研究了五元CBPs混合物对青海弧菌的毒性特点,观察到组分不同浓度配比可导致加和或拮抗作用。

等效线图是评价混合物组分间毒性相互作用的常用方法,已用于评价麦田2种除草剂混合物[12]和稻田2种杀虫剂混合物[13]的联合作用,确定两种止痛药的加和作用药效[14],表征抗菌药物的抑菌动力学[15]等。大多数情况中等效线图用于分析二元混合物的毒性相互作用。参考等效线的空间几何意义,对于三元混合物,可构建等效面进行分析,如刘雪等[16]以CA为参考模型,建立了3种除草剂及3种杀虫剂在50%效应水平下的三维等效面,分析得出三元除草剂混合物呈加和作用,三元杀虫剂混合物呈现加和作用与拮抗作用。顾中言等[17]用甲维盐、毒死蜱、吡蚜酮3种药剂对害虫的LC50值作理论等效面,研究了田间试验中混剂对害虫的毒力和互作效应。然而,基于实验设计方法应用等效面来系统分析三元CBPs联合毒性作用规律的研究鲜有报道。

化学物联合毒性的评估和预测通常基于CA和IA两个加和参考模型。CA一般用于预测具有相似毒性作用机制的混合物。CA模型表明,只要毒性单位的总和保持不变,混合物中的每种化合物都可以被另一种化合物替代而不改变总毒性[18]。CA模型在笛卡尔坐标空间可表示为图形,对于二元混合物是直线形式的等效线,对于三元混合物则是平面三角形形式的等效面。而IA模型通常适用于相异毒性作用机制的化学物质构成的混合物。IA假定毒物首先与不同的分子靶点相互作用,经过生物体内不同的连锁反应,产生一个共同的毒理学指标;在此假设下,混合物中各组分的效应在概率意义上被认为是彼此相互独立的[19]。

本研究选择残杀威、灭多威、速灭威作为代表性CBPs农药组分,采用直接均分射线法配制两两组合的二元混合物,采用均分等效面设计法配制三元混合物,基于微板毒性分析法测定混合物对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制效应,建立三者观测的等效面,通过比较观测与CA、IA预测的等效面来分析混合物的毒性相互作用,为CBPs在环境中复合污染的风险评估和农业上的合理施用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

Synergy2型多功能微孔板测定仪(美国BioTek公司),AL204型四位电子天平(梅特勒-托利多公司),雷磁PHS-3E型pH计(上海精密科学仪器有限公司),96孔透明微板(Corning 9018)。

碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、电鳗AChE、残杀威(propoxur,PPX)、灭多威(methomyl,MTM)与速灭威(metolcarb,MTC)相关的具体信息见表1。ATCI、DTNB、AChE、PPX、MTM与MTC分别溶解于pH 6.8的磷酸盐缓冲液(含0.025 mol/L KH2PO4与0.025 mol/L Na2HPO4·12H2O)并避光保存于4 ℃冰箱中。为溶解DTNB,每克DTNB添加0.379 g的NaHCO3[20]。

1.2 方法

1.2.1 混合物實验设计 基于残杀威、灭多威与速灭威的储备液浓度(c0)与EC50,采用均分等效面设计法(待发表),将构成50%效应等效面的3条等效线各自3等分,从等分点分别作对面2条等效线的平行线,从而将等效面均分为9个全等三角形,将这9个小三角形的重心坐标对应于3个组分的9个浓度配比,设计组分毒性单位比依次为1∶1∶7、4∶1∶4、2∶2∶5、1∶4∶4、7∶1∶1、5∶2∶2、4∶4∶1、2∶5∶2、1∶7∶1的9条混合物射线(G1~G9)。同时依据经典方法设置EC50比混合物射线G0。对于二元混合物,利用直接均分射线法[21]按照毒性单位比1∶5、2∶4、3∶3、4∶2、5∶1两两混合设计B1~B15的二元混合物射线,其中B3、B8、B13为EC50比混合物射线。这些混合物射线中各组分的浓度分数见表2。

1.2.2 乙酰胆碱酯酶微板毒性分析 采用基于AChE的微板毒性分析法(待发表),在96孔微板的前11列设置11个对数梯度浓度污染物,第12列设置空白对照,每孔依次加入50 μL 1 g/L的DTNB、50 μL 1 g/L的ATCI、50 μL 0.2 U/mL的AChE,于412 nm下测定0 min与15 min的OD值,全程使用空调控温(29±1) ℃。

污染物对AChE的抑制效应E按照公式(1)计算,得到的剂量-效应曲线(DRC)使用公式(2)所示Weibull函数进行最小二乘法拟合并求95%的观测置信区间[22],

计算得到效应浓度如EC80、EC50、EC20等。

式中ΔODt为处理溶液15 min时吸光度变化值,ΔODc为对照溶液15 min时吸光度变化值,C为浓度,E为效应,a为位置参数,b为斜率参数。

1.2.3 混合物毒性预测与评估 使用公式(3)所示CA模型与公式(4)所示IA模型构建混合物的等效面,对混合物毒性进行预测与评估。为了验证等效面分析法,同时采用简单、实用的共毒系数法[23]评估混合物的毒性相互作用。将3个组分中毒性最大的灭多威(MTM)作为标准药剂,各组分的毒力指数(toxicity index,TI)按公式(5)计算,混合物的理论毒力指数(theoretical toxicity index,TTI)按公式(6)计算,混合物的实际毒力指数(actual toxicity index,ATI)按公式(7)计算,根据公式(8)求得混合物的共毒系数(co-toxicity coefficient,CTC)。混合物CTC值小于80%为拮抗作用,大于120%为协同作用,80%~120%之间为加和作用。

式中n是混合物的组分数,ci是产生效应x%的混合物中组分i的浓度,ECx,i是组分i单独引起x%效应时的浓度,ECx,mix是产生x%效应的混合物浓度,Pi是组分i在混合物中的浓度分数,Emix为混合物的效应,Ei为组分i产生的效应。

2 结果与分析

2.1 单个化合物剂量-效应曲线分析

从图1可看出,残杀威、灭多威、速灭威对AChE抑制毒性的DRC呈良好的S型曲线,空白变异在测试中控制在了±10%以内。DRC经最小二乘法回归的统计参数见表2,均方根误差(RMSE)均小于0.03,决定系数(R2)均大于0.99,拟合统计性显著。故单个物质DRC可用Weibull函数有效表征,拟合得到的参数如DRC位置参数a、斜率参数b、EC80(80%效应浓度)、EC50(50%效应浓度)、EC20(20%效应浓度)等列于表2。

残杀威、灭多威、速灭威的a值分别为9.360、9.466、6.495,残杀威与灭多威的a值相差不大,两者的毒性差异也不大,但与速灭威的毒性差异较大。基于EC50,可得出对AChE抑制效应的大小顺序为:灭多威>残杀威>速灭威,灭多威与速灭威EC50的差距接近两个数量级,单个物质各自的EC80与EC20的差距接近一个数量级。3个物质的b值分别为1.834、1.753、1.760,表明三者DRC曲线的陡度接近,毒性随浓度的增加变化趋势也相近(图1)。

2.2 基于剂量-效应曲线的混合物毒性分析

图2为三元混合物射线G0~G9与二元混合物射线B1~B15对AChE的DRC。结果表明,所有混合物射线的DRC都可用Weibull函数有效拟合,R2均大于0.99,RMSE均小于0.03。拟合得到混合物射线的效应浓度EC80、EC50、EC20同列于表2。观察后发现,二元或三元混合物射线的EC80、EC50、EC20都分别位于组分EC80、EC50、EC20的最大值与最小值之间。

综合来看,对于三元及二元混合物射线,CA模型预测的DRC均位于观测DRC的95%置信区间内,混合物呈现加和作用,其中G0、G1、G4、G6、G7、G9、B2、B3、B5~B7、B9~B15混合物射线的观测DRC良好符合CA预测的DRC。而IA模型轻微地高估了混合物毒性,同时IA预测的DRC均在CA预测DRC的上方。

2.3 基于等效面的混合物毒性相互作用分析

图3为三元混合物在20%、50%、80%效应的等效面的正视图及侧视图,包括混合物观测等效面、CA预测等效面和IA预测等效面三部分组成。图3中的黑点为观测等效点,共28个,分别是三角形边线上的15个二元混合物观测等效点,三角形内10个三元混合物的观测等效点,三角形3个顶点的单个组分的观测等效点,所有的黑点都是等效应的。黑点两侧的黑线为其95%置信区间,二元混合物观测等效点的置信区间在正视图中给出,三元混合物观测等效点的置信区间在侧视图中给出。

这28个等效点通过基于三角形的三次方程插值得到混合物的观测等效面,即图中的网格曲面。而CA预测的等效面为图3中的红色三角形平面,IA预测的等效面为向内凹的蓝色三角形曲面。三角形等效面的3条边为相应二元混合物的观测或预测的等效线。基于模型(CA与IA)预测的三元混合物等效面与二元混合物等效线的数学方程见表3。

图3的20%、50%、80%效应的等效面正视图中,二元混合物的15個观测等效点基本都符合CA模型;IA预测等效线相对CA内凹,但总体上也位于观测点的置信区间内。在侧视图中,网格显示的观测等效面均位于CA与IA构成的加和性空间中,其中80%效应的观测等效面很好地符合CA模型。基于图3的等效面分析可知,残杀威、灭多威、速灭威的三元及二元混合物在20%、50%、80%效应水平均为加和作用。上述结果与基于DRC的分析一致。

2.4 共毒系数法验证

从表4可知,除G3在20%效应水平的CTC为120.48%外,G0~G9混合物射线在20%、50%、80%效应水平的CTC值的范围为93.01%~113.82%,呈现良好的加和作用。这与基于剂量-效应曲线及基于等效面的混合物毒性相互作用分析结果相同。共毒系数法与CA等效面法判断结果一致,进一步证明等效面法可用于三元混合物毒性相互作用分析与判断的可行性。

2.5 混合物毒性与单个物质浓度分数的关系

将单个组分浓度分数与三元混合物毒性(pEC20、pEC50、pEC80)做散点图,观察到混合物毒性与残杀威、灭多威的浓度分数没有明显的相关关系,但两者散点图的分布模式较为相似;混合物毒性与最小毒性组分速灭威的浓度分数具有较好的负相关(R2均大于0.91),拟合曲线见图4。这表明混合物毒性可能与其中组分的浓度分数具有相关关系。

3 讨论

农药混配后所产生的联合作用与药剂种类[10]和混配比例[24]密切相关。同种药剂由于作用靶位点相同,理论上呈现加和作用。其中有机磷农药作为较早进行联合暴露风险评估的化合物[25],研究尤为深入。二元有机磷混合物大多数呈现加和作用[26],也有部分呈现协同作用如毒死蜱和马拉硫磷[27],部分呈现拮抗作用如辛硫磷与甲基对硫磷[10]。少数报道评估了氨基甲酸酯类农药的联合作用。如涕灭威、残杀威、呋喃丹、灭多威、抗蚜威对青海弧菌的联合毒性研究中,观察到拮抗作用多于加和作用,混合物毒性与组分毒性处于中间的灭多威的浓度分数呈良好的负相关性[11]。而本研究中混合物毒性与最小毒性组分速灭威的浓度分数具有较好的负相关。另一方面,Ge等[28]在研究苯胺类、硝基苯类、苯酚类和邻苯二甲酸酯混合物对发光菌Q67的联合作用时,观察到混合物毒性与最大毒性组分邻苯二甲酸二乙酯的浓度分数具有良好的正相关关系。

残杀威、灭多威、速灭威对AChE的联合作用符合CA加和作用。一般认为混合物组分具有相似毒性作用机制时可采用CA预测,若相异则可采用IA预测[19]。事实上,CA与IA仅是2个数学方程,与化合物毒性作用机制联系起来还需要从机理方面进行严格的论证;但在实际情况中,CA用于相似作用物的机会更多一些。刘树深等[29]认为CA仍只是一个工作模型,没有坚实的理论支持,也不宜与作用机理相关联。

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