超声波和微波对柑橘杂交种果皮中酚类物质浸提及其抗氧化能力的影响

陈源 姜翠翠 谢鸿根 郭龙 余文权 杨道富

摘 要 以柑橘杂交品种葡萄柚、茂谷橘橙果皮为材料，研究超声波和微波对柑橘果皮提取物中酚类物质及其抗氧化活性的影响。结果表明：葡萄柚果皮中含有丰富的柚皮苷、芦丁、橙皮素等酚类物质，茂谷橘橙果皮中含有丰富的槲皮素、川陈皮素、橙皮素等酚类物质。葡萄柚果皮提取液的抗氧化活性高于茂谷橘橙。葡萄柚果皮超声波提取液中酚类物质的含量和抗氧化活性高于微波提取液。柑橘果皮提取物中酚类物质的含量与其DPPH自由基和羟自由基清除能力呈正相关。此结果说明超声波提取法可提高葡萄柚果皮中酚类物质的提取率和提取液抗氧化能力。

关键词 柑橘果皮；微波提取；超声波提取；酚类物质；抗氧化活性

中图分类号 S666 文献标识码 A

Abstract With scavenging rate of DPPH and hydroxyl radical as the index， we studied the effects of microwave and ultrasonic treatment on the extraction， chemical structure and antioxidation properties of citrus phenolics from grapefruit and Murcott peel. Results showed that naringin， rutin and hesperedin were the predominant phenolics in grapefruit peel. Quercetin， nobiletin， hesperidin were the predominant phenolics in Murcott peel. The content of phenolic compounds and antioxidant activity of ultrasonic extraction was higher than that of microwave extraction. The phenolic content of extraction showed a significantly positive correlation with antioxidant abilities. Ultrasonic treatment obviously improved the phenolic content and antioxidant activity of the grapefruit peel. Grapefruit and Murcott may be used as good natural antioxidants as well as important basic materials of functional foods and biomedicinals.

Key words citrus peels； microwave extraction； ultrasonic extraction； phenolic compounds； antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.030

柑橘是全世界第一大類水果，也是世界第三大贸易农产品。2015年，我国柑橘栽培面积位居世界第一，产量居第三位[1]。2015年，全国柑橘面积251.30万hm2，产量3 660.08万t。在柑橘的鲜食过程中，占鲜质量近一半的果皮大部分被直接丢弃，不仅造成了资源浪费，而且污染了环境。近年来，柑橘果皮的综合加工利用渐渐引人注目[2]。酚类物质是柑橘果皮中主要的活性物质，具有强抗氧化性，是活性物质及功能性食品领域重要的研究对象。国内外对柑橘酚类物质的研究多集中在甜橙、蜜橘、宽皮橘、葡萄柚、柚、柠檬、酸橙等品种中酚类物质含量及其抗氧化性的研究上[3-7]。微波、超声波提取是近年常见的提取方式，具有时间短、产率高等优点，目前广泛应用于植物多酚的浸提[8-9]。葡萄柚和茂谷橘橙是我国近年来推广的柑橘杂交品种。其中，葡萄柚是柚和橙的杂交种，茂谷橘橙是宽皮橘和橙的杂交种。本试验以这2种杂交柑橘的果皮为研究对象，分析微波和超声波法提取对柑橘果皮中酚类物质浸提效果及其抗氧化活性的影响，旨在为柑橘果皮酚类物质的高效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 本试验所用的材料为葡萄柚（产自福建建瓯）和茂谷橘橙（产自福建平和）。先将新鲜的柑橘手工剥皮，再将果皮置于-30 ℃条件下冷冻24 h，冷冻抽真空干燥48 h。将冻干的柑橘果皮用小型的粉碎机粉碎，过筛得到60目的干样粉末。

1.1.2 试剂 标准品没食子酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、芦丁、阿魏酸、橙皮苷、柚皮苷、水杨酸、槲皮素、川陈皮素、桔皮素、儿茶素、表儿茶素、苯甲酸、白藜芦醇等均购自Sigma公司；无水乙醇、二苯代苦味酰基自由基（DPPH）、邻苯三酚等试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 紫外分光光度计：TU-1810（北京普析通用仪器有限责任公司）；L-2000高效液相色谱仪（日本日立公司）；高速万能粉碎机：FW100（天津泰斯特仪器有限公司）；分析天平：Sartorius BS224S（德国赛多利斯）；微波炉：G80L20SCL-DG（广州Galanz公司）；高速冷冻离心机：ALLEGRATM64R（美国BECKMAN公司）；FDU-1200冷冻干燥机（日本EYELA公司）；艾柯超纯水系统：AKWL-IV-50（成都康氏康宁科技发展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 微波提取 优化后的条件：准确称取0.5 g柑橘皮粉末，放入100 mL的三角锥瓶中。茂谷橘橙微波条件：加入23.5 mL 80%的乙醇，微波功率640 W，提取时间35 s，9 000 r/min离心5 min，重复提取3次[3]。葡萄柚微波提取条件：加入35 mL 80%的乙醇，微波功率160 W，提取时间50 s，9 000 r/min离心5 min，重复提取3次。合并上清液，定容[3，10]。用0.22 ?m膜过滤提取液，收集滤液进行抗氧化活性和酚类物质含量的测定。

1.2.2 超声提取 优化后的条件：准确称取0.5 g柑橘皮粉，放入100 mL的三角锥瓶中。茂谷橘橙超声波提取的条件：加入35.0 mL 80%的乙醇，提取时间20 min，9 000 r/min离心5 min，重复提取3次[11]。葡萄柚超声波提取的条件：加入19 mL 80%的乙醇，提取时间21 min，9 000 r/min离心5 min，重复提取3次。合并上清液，定容。用0.22 ?m膜过滤提取液，收集滤液进行抗氧化活性和酚类物质含量的测定[12]。

1.2.3 酚类物质高效液相色谱（HPLC）分析 根据液相色谱条件对柑橘中常见酚类物质进行上样分析，经过二极管阵列检测器测定，通过与标准品的比较定性、定量。其中的11种酚类物质标准品分别为绿原酸、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水杨酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、槲皮素、川陈皮素、橘皮素。

色谱条件如下：色谱柱：Merck LiChrospher_100RP18e（250 mm×4.0 mm 5 ?m）；流動相：A：2%乙酸-水，B：乙腈；洗脱程序：0～100 min，（A）：84%～30%，（B）：16%～70%；柱温：30 ℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 ?L；检测波长：0～20 min：230 nm；20～35 min：280 nm；35～42 min：309 nm；42～60 min：280 nm。

1.2.4 DPPH自由基清除能力测定 参照蒋超等的方法[13]并略作修改。将样品适当稀释，取3 mL样品与3 mL 0.1 mg/L DPPH溶液混合，置暗处反应30 min，于517 nm处测定吸光度Ai。同时测定0.1 mg/L DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Aj。DPPH清除率=[ Ac-（Ai-Aj）/Ac]×100%。试验重复3次。

1.2.5 羟自由基（·OH）清除能力的测定 利用H2O2和Fe2+发生Fenton反应生成的羟自由基，测定柑橘果皮提取液对羟自由基的清除率。参考李维新等的方法[14]，反应体系中包含2 mL 2 mol/L 的FeSO4溶液和2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，向其中加入待测提取液1 mL，再加入2 mL 6 mmol/L 的H2O2，在37 ℃条件下反应30 min，以蒸馏水作对照，在510 nm下测吸光度，试验重复3次。

1.2.6 数据处理 所有试验均重复3次，结果所列数据取3次重复的平均值。采用SPSS 19. 0对数据进行处理，试验数据采用ANOVA进行邓肯氏多重差异分析（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 超声波和微波对葡萄柚、茂谷橘橙果皮中酚类物质含量的影响

由表1可知，葡萄柚果皮超声波提取液中含量较高的酚类物质依次为：柚皮苷>芦丁> 水杨酸>橙皮苷；茂谷橘橙果皮超声波提取液中酚类物质的含量依次为：槲皮素>水杨酸>川陈皮素>橘皮素>柚皮苷>芦丁>阿魏酸>苯甲酸>橙皮苷。微波法测得的葡萄柚果皮总酚含量和总黄酮含量显著高于超声波法（p<0.05），而微波法测得的茂谷橘橙果皮总酚含量和总黄酮含量与超声波法相比差异不显著（p<0.05）。此外，超声波法提取的葡萄柚果皮中绿原酸、香豆酸、水杨酸、芦丁、柚皮苷、橙皮苷、槲皮素、川陈皮素、橘皮素等酚类物质的含量显著高于微波法（p<0.05）。超声波法和微波法提取的茂谷桔橙果皮中多数酚类物质的含量差异不明显（p<0.05）。

2.2 DPPH自由基清除率

分别采用超声波法和微波法得到柑橘果皮提取液中酚类物质对DPPH自由基的清除率结果见图1。对DPPH自由基清除能力的顺序为：葡萄柚超声波提取>茂谷橘橙超声波提取>葡萄柚微波提取>茂谷橘橙微波提取。超声波和微波提取物的多酚浓度在20～150 ?g/mL时，随着浓度的增大，对DPPH自由基的清除能力明显增强，DPPH自由基清除率在一定范围内与样品的浓度呈剂量效应关系。当浓度为150～400 ?g/mL时，超声波提取物的DPPH自由基清除率增加速度放缓，同一品种不同提取方法之间清除DPPH自由基能力差异显著（p<0.05）。

2.3 羟自由基清除率

采用超声波和微波的方法得到的柑橘果皮提取液对羟自由基的清除率见图2。葡萄柚2种方法提取的清除羟自由基能力差异较明显，超声波提取法得到的柑橘果皮提取液对羟自由基的清除率显著高于微波提取法，提取液中多酚浓度在20～150 ?g/mL时，随着浓度的增大，对羟自由基清除能力明显增强，对羟自由基的清除能力在一定范围内与提取物的总酚浓度呈剂量效应关系。当浓度为150～400 ?g/mL时，超声波提取物的DPPH清除率增加速度放缓。超声波法和微波法得到的茂谷橘橙果皮提取液对羟自由基的清除率差异不显著（p<0.05）。

2.4 酚类物质含量与抗氧化活性之间的相关性

葡萄柚和茂谷橘橙超声波微波提取中总酚、总黄酮和清除DPPH能力、清除羟自由基能力的相关系数（R）见表2。葡萄柚和茂谷橘橙果皮中总酚和总黄酮含量呈极显著正相关关系（p<0.01）， 总酚和总黄酮含量与羟自由基清除率呈显著正相关关系（p<0.05）。这表明柑橘果皮中总酚和总黄酮含量和羟自由基清除能力基本趋于一致，清除羟自由基能力强的其总酚和总黄酮含量也高，能力弱的其总酚和总黄酮含量也较低。

3 讨论

3.1 葡萄柚和茂谷橘橙果皮中酚类物质的组成和含量

酚类物质是柑橘果实中主要的生物活性物质，主要包括类黄酮、酚酸和多甲氧基类黄酮等。研究表明，不同品种的柑橘果实中酚类物质组成和含量有较大差异[15-16]。宽皮橘中类黄酮以柚皮苷、芦丁、橙皮苷为主，大翼橙类和柚类中类黄酮以柚皮苷为主，葡萄柚中类黄酮以新橙皮苷、柚皮苷、圣次草苷为主[17-21]。酚酸主要以肉桂酸型酚酸为主。宽皮橘中酚酸含量排列顺序为：阿魏酸>香豆酸和咖啡酸>芥子酸[22]。柚果实中以阿魏酸含量最高，其次是香豆素、咖啡酸和芥子酸[23]。多甲氧基黄酮是柑橘特有的高度甲基化的黄酮类化合物，具有良好的抗氧化、抗炎、治疗心血管疾病、降血脂和改善胰岛素分泌等多种功能[24]。甜橙果皮中多甲氧基黄酮主要是川陈皮素，其次是橙黄酮和橘皮素[25]。葡萄柚果实中多甲氧基黄酮主要以橘皮素为主[7]。

本研究結果表明，葡萄柚果皮中类黄酮以柚皮苷、芦丁、橙皮苷和槲皮素为主，茂谷橘橙果皮主要以槲皮素、柚皮苷、芦丁和橙皮苷为主。葡萄柚果皮中酚酸含量排列顺序为水杨酸>绿原酸>苯甲酸。两个品种果皮中多甲氧基黄酮均以川陈皮素和橘皮素为主。果皮酚类物质的组成和含量测定结果表明，茂谷橘橙兼有橙类和宽皮橘类品种的特点，葡萄柚兼有橙类和柚类品种的特点。

3.2 超声波法和微波法对酚类物质和其抗氧化活性的影响

不同的提取方式得到的提取液，其酚类物质含量不同，因此适当的提取条件是获得高含量酚类物质的重要因素之一[27]。微波法主要通过加热使细胞内的极性物质尤其是水分子发生偶极旋转，液态水汽化产生的压力冲破细胞膜和细胞壁，从而使胞外溶剂更容易进入细胞内，增加了与目标物的可及性，提高了传质的推动力[28]。超声波提取法不仅具有微波的热效应，同时还具有机械和空化效应，通过增大介质分子的运动速度、穿透力，使有效成分呈游离状态并溶入提取介质中。研究表明低超声辐射面和超声能量能显著影响咖啡酸的稳定性，增加其抗氧化性，同时低频超声波处理能增加温州蜜柑、琯溪蜜柚等柑橘果皮中酚类物质的析出[28-32]。温州蜜柑、琯溪蜜柚果皮提取物的抗氧化性可能与总酚有关[31-32]。聂超等人利用加热浸提法对甜橙果皮中黄烷酮和多甲氧基黄酮的影响及其抗氧化活性进行研究，结果表明甜橙果皮抗氧化性与提取物中总黄酮含量呈极相关[33]。秦艳利用传统溶剂法提取脐橙果皮中多酚物质，结果表明光照强度、温度、pH值等不同的处理因素会影响脐橙果皮中多酚的含量，脐橙果皮中多酚含量与其抗氧化性相关性较强，脐橙果皮的抗氧化性会随着多酚含量的改变而发生较大的变化[34]。前人的研究集中在不同方法对宽皮橘、柚和橙类品种的果皮或皮渣中总酚、总黄酮、咖啡酸和酚酸等物质提取的影响。杂交种果皮中含有更为多样的酚类物质，因此本研究比较超声波和微波提取方法对葡萄柚与茂谷橘橙果皮中酚类物质的提取及抗氧化活性的影响，结果表明：葡萄柚果皮超声波提取液中总黄酮、总酚、11种酚类物质得率和羟自由基清除率显著高于微波提取得率，超声波提取较微波提取能更有效提取葡萄柚果皮中的酚类物质，而茂谷橘橙果皮超声提取和微波提取酚类物质得率、DPPH和羟自由基清除率差异不显著。酚类物质提取的最佳条件与获得最高抗氧化活性的提取条件一致，葡萄柚和茂谷橘橙果皮酚类物质的组成和抗氧化活性呈正相关。

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