过氧化氢酶2不参与调控拟南芥根部对镉胁迫的耐受性

贾骐骏

摘要[目的]探讨过氧化氢酶（CAT2）在拟南芥根部响应镉胁迫过程中对主根生长、活性氧积累以及生长素信号的影响。[方法]在1/2 MS固体培养基中加入不同浓度的镉处理拟南芥Col-0和CAT功能缺失突变体cat2幼苗。[结果]研究发现镉胁迫会抑制主根的根长，而cat2的根长的抑制率与Col-0并无明显差异。镉处理后Col-0和cat2根中CAT活性也不会发生显著变化。进一步比较Col-0和cat2根在镉胁迫下的活性氧的积累，两者活性氧增长率大致相同。最后检测DR5：：N7-VENUS和cat2 DR5：：N7-VENUS根中生长素的信号表达，发现镉胁迫对Col-0和cat2根中生长素的抑制率也没有差异。[结论]CAT2不参与调控拟南芥根部对镉胁迫的耐受性。

关键词 拟南芥；镉胁迫；过氧化氢酶；活性氧；生长素

中图分类号 Q945.78 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0001-04

Abstract[Objective]Impact of catalase was discussed in the article based on the result of primary root length， reactive oxygen species accumulation and auxin signal in the primary root of Arabidopsis thliana responsive experiment under cadmium stress.[Method]Different concentrations of cadmium were added to 1/2 MS solid medium to treat Arabidopsis Col0 and CAT2 lossoffunction mutant cat2 seedlings.[Result]The study found that cadmium stress inhibited the root length of the main root， but the inhibition rate of cat2 root length was not significantly different from that of Col0.However， the root length results between cat2 and Col0 were no obvious differences. A similar conclusion also could be derived from the CAT activity in primary root after the cadmium stress treatment. Further comparing the accumulation of active oxygen in the roots of Col0 and cat2 under the cadmium stress， the growth rate of their active oxygen is roughly the same. Finally， the signal expression of auxin in Col0 DR5：：N7VENUS and cat2 DR5：：N7VENUS roots was detected. It was found that there was no difference in the inhibition rate of auxin in Col0 and cat2 roots by cadmium stress.[Conclusion]CAT2 is not involved in the regulation of tolerance to cadmium stress in Arabidopsis roots.

Key words Arabidopsis thaliana；Cadmium stress；Catalase； Reactive oxygen；Auxin

近些年，重金屬污染已经威胁到工农业的持续健康发展，严重影响农作物的品质和产量，造成巨大的经济损失。其中，高毒性、高水溶性的镉（Cd）容易被植物吸收在体内富集，影响植物正常的生长发育和新陈代谢，最终造成植物死亡[1]。而这些被镉污染的植物通过食物链进入人体后，积累到一定剂量会引起急性或慢性中毒，损害肝脏、肾脏、骨骼，甚至引发癌症[2]。

Cd胁迫抑制植物根系发育，庞大的根系不仅能够支持固定整个植株，而且不断地从土壤中吸收植物生长所必需的营养物质，满足地上植物组织生长、发育、代谢需求[3-7]，当植物受到土壤中镉胁迫后，根作为第一道防线直接参与植物对胁迫的应激响应；Cd胁迫诱导活性氧（ROS）的积累，破坏生物大分子及细胞的完整性，影响植物生长必需元素（Fe、Ca、 Mg、P 和 K）和水分的吸收、运输及抗氧化酶的活性，从而抑制植物生长发育[8-9]；Cd胁迫会抑制植物体内生长素表达分布，有研究表明，当植物受到Cd胁迫后，植物体内的生长素的合成和极性运输被抑制，主根长度变短，侧根数量减少，植物可以动态和差异性的调节生长素相关基因的转录，使植物在逆境下更好地适应和生存[10-11]。

植物在受到Cd胁迫后会激活多种响应途径来抵抗或减弱胁迫程度。植物首先会限制Cd的吸收与运输，将大部分吸收的Cd储存在根部液泡中，减少Cd由根系向地上部的转运[12-13]；然后植物螯合素与Cd结合，降低细胞内游离的Cd2+，减轻对植物的毒害[14]；Cd胁迫诱导ROS在植物体内大量积累，这些ROS随后被超氧化物气化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸氧化酶（APX）、谷胱甘肽（GSH）等构成的抗氧化系统所清除进而避免植物受到氧化胁迫[15-18]。

CAT是ROS清除体系的重要组成部分，主要负责清除H2O2 [19]。Cd胁迫能够不同程度地改变植物体内抗氧化酶的活性，表明包括CAT在内的抗氧化酶参与植物对Cd胁迫的响应[20]。CAT是否参与拟南芥根对Cd胁迫的耐受性响应并没有被明确报道，拟南芥中已经报道的共有3个CAT基因，其中CAT2是植物CAT的主要形式。因此，借助CAT2缺失突变体cat2，以期探究CAT2是否参与到植物根部对Cd胁迫的调控响应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。拟南芥（Arabidopsis thliana）哥伦比亚野生型（Col-0）、T-DNA插入突变体cat2（SALK_057998）、转基因材料DR5：：N7-VENUS、cat2 DR5：：N7-VENUS。

1.1.2

主要试剂。MS，KH2PO4，K2HPO4，蔗糖，2-吗啉乙磺酸，琼脂粉，氯化镉（CdCl2），聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），抗坏血酸（ASC），DCFH-DA荧光染料，无水乙醇，次氯酸钠。

1.1.3

主要仪器。垂直培养板，灭菌锅，激光共聚焦显微镜LSM710，扫描仪，超净工作台，冰箱，pH计，紫外分光光度计。

1.2 方法

1.2.1

拟南芥种子消毒。取少量拟南芥种子于离心管中，超净工作台内加入70%乙醇浸泡5 min，弃上清；向离心管中加入25%次氯酸钠，振荡后静置15 min，弃掉上清；向离心管中加入1 mL无菌ddH2O振荡弃掉上清，重复6～8遍；用无菌枪头将种子均匀地点到1/2 MS固体培养基培养板上，晾干后用透气胶带封口，4 ℃冰箱内低温春化3 d后将培养板放入植物人工气候室进行生长7 d。生长条件：光照强度分为80～100 μmol/（m2·s）、16 h光照、8 h黑暗、温度22 ℃（白天）/20 ℃（夜晚）、湿度60%。

1.2.2

拟南芥杂交。待拟南芥cat2和Col-0 DR5：：N7-VENUS正常生长到抽薹开花后，取尚未开花的花苞作为母本，开花势头较好的花作为父本。将父本的花粉涂抹在已经去除势的母本柱头上，低光3 d后转正常光照，待荚果成熟后所得即为杂合F1代，自交产生F2代，从中分离出纯合的cat2 DR5：：N7-VENUS[21]。

1.2.3

镉胁迫处理。配制0.1 mol/L CdCl2母液，根据终浓度将一定体积的CdCl2加入1/2 MS培养基中混匀，倒入一次性培养板待凝固后即可使用，试验使用工作浓度为0、10、30 μmol/L。在超净工作台中，用无菌镊将6 d的苗移到胁迫培养基中处理4 d，扫描后统计根长。

1.2.4

根长统计及分析。扫描仪扫描10 d左右拟南芥整株形态，Image-J测量每棵幼苗的主根长度，Excel对数据进行计算和分析。

1.2.5

ROS染色（DCFH-DA法）。将DCFH-DA母液加入预冷的pH 6.0磷酸钾缓冲液，配成终浓度为含有100 μmol/L DCFH-DA的荧光探针染液，避光保存；取7 d生长状态一致的幼苗，低温孵育15 min后，使用磷酸钾缓冲液漂洗3～5遍后制片；激光共聚焦观察荧光信号表达，激发光488 nm，发射光525 nm，单通道扫描[22]。

1.2.6

CAT酶活测定。取200～300 mg 拟南芥根部，液氮充分研磨后加入100 mg PVPP，然后加入1.5 mL 0.1 mol/L NaH2PO4/1 mmol/L EDTA（pH 7.5），1 mmol/L ASC，4 ℃，12 000 g，10 min，吸取1 mL上清液转移到新离心管中，置于冰上后备用；使用紫外分光光度计测定CAT酶活，反应体系为：880～970 μL缓冲液+20 μL 30%H2O2+10～100 μL酶提取液，充分混匀后，反应90 s。记录30～60 s斜率数，最后根据公式计算CAT酶活。

2 结果与分析

2.1 不同浓度Cd对Col-0和cat2根长的影响

使用CAT功能缺失突变体cat2探究CAT是否参与植物根部对Cd胁迫的调控响应。选取垂直培养至6 d、大小均一的拟南芥幼苗，使用浓度为0、10、30 μmol/L CdCl2进行4 d胁迫处理。结果如图1所示，在1/2 MS培养基上生长的苗的根部随着Cd浓度的增加，Col-0和cat2根长受到抑制，侧根数量减少，地上部出现明显的黄化表型。在30 μmol/L Cd处理条件下，与对照组相比，Col-0和cat2主根根长抑制率约为23%和16%，并无显著性差异。表明CAT2功能缺失并不影响拟南芥根部对Cd的耐受性。

2.2 不同浓度Cd对ROS积累的影响

重金属胁迫能够诱导植物体内产生大量ROS，破坏植物体内的氧化平衡状态，造成植物受到氧化损伤。试验借助激光共聚焦顯微镜使用DCFH-DA荧光探针对Cd处理的拟南芥根部ROS积累情况进行分析。正常情况下，Col-0根中的ROS积累较弱，而随着Cd浓度的增加，根中的ROS逐渐增加。30 μmol/L Cd处理后，Col-0根中的ROS有明显增加；由于cat2中CAT功能缺失，不能及时清除体内产生的H2O2，故体内氧化水平处于较高的水平，从图2可以看出，cat2在0 μmol/L时根部的ROS水平显著高于Col-0，当cat2受到Cd处理后，体内的ROS会随着Cd浓度的积累而增加。10 μmol/L时，和对照组相比，cat2根部的ROS并没有显著变化，而在30 μmol/L时，Col-0、cat2根中ROS都明显增加，与对照组相比，Col-0的ROS增加了114.7%，cat2增加了93.3%，并无显著性差异。表明CAT2可能不参与Cd胁迫下拟南芥根对ROS积累的调控。

2.3 不同濃度Cd对CAT活性的影响

CAT活性能够反应出植物对H2O2的清除能力。取Cd处理7 d后的Col-0、cat2根部，测定其根部CAT活性。从图3可以看出，随着Cd浓度的增加，cat2根部的CAT活性均没有明显的变化。由于CAT2突变，和Col-0相比，cat2根部的CAT酶活性下降约80%，表明Cd胁迫对拟南芥根的CAT活性没有明显影响。

2.4 不同浓度Cd对生长素信号的影响

研究发现重金属胁迫会影响生长素在植物根中的合成、运输、信号转导。为了进一步确定CAT2在拟南芥根响应Cd胁迫后生长素的作用，用cat2与生长素报告基因Col DR5：：N7-VENUS杂交从F2代中分离出纯合的cat2 DR5：：N7-VENUS，激光共聚焦显微镜检测生长素荧光信号表达。结果如图4 所示，Col DR5：：N7-VENUS根中生长素表达强烈，但随着Cd处理浓度的增加，根尖、中柱鞘、外层细胞中荧光强度逐渐减弱，表明Cd胁迫会改变拟南芥根的中生长素信号表达；而对照组中cat2 DR5：：N7-VENUS与Col DR5：：N7-VENUS相比，根中荧光强度降低，30 μmol/L Cd处理后，根中生长素信号随之降低，进一步分析荧光强度发现，和对照组相比，Col-0和cat2的荧光强度分别下降了29.4%和36.6%，并无显著性差异。

以上结果表明CAT2缺失可能会减少根中生长素的信号，但并不参与Cd胁迫下拟南芥根部对生长素的调控。

3 讨论

在长期的进化过程中植物演化出多种抵抗重金属的防御机制，多种抗氧化酶参与植物对重金属胁迫的响应已经得到证实。试验使用Cd浓度梯度处理模式植物拟南芥Col-0和CAT2功能缺失突变体cat2，分析统计主根长度发现，cat2主根根长的抑制率低于Col-0，说明CAT2可能不参与Cd对拟南芥根长抑制的调节。通过测定不同浓度Cd处理后的Col-0、cat2根中的CAT活性，进一步证明cat2受到Cd胁迫后根中的CAT活性无显著变化。ROS和生长素作为重要的信号分子，广泛参与到植物生长发育、新陈代谢、胁迫响应等众多生理生化反应的调控。分析Cd处理后根中的ROS积累发现，CAT2不参与到Cd胁迫下拟南芥根中对ROS的调控。通过比较根中生长素报告基因的荧光强度，发现CAT2也不参与Cd胁迫抑制根中生长素的信号表达的调控。

研究报道，镉处理玉米幼苗后，根中CAT的活性和蛋白含量会下调，而转录水平会随着处理时间而增加，并改变转录后的蛋白空间结构[23]。当小麦受到Cd胁迫后，CAT活性降低会抑制K+/Na+比率，进而破坏离子通道的正常交换，影响扩膜运输效率[24]。而该试验发现拟南芥受到镉胁迫后，根中CAT酶活并未发生显著变化，这可能由于不同植物对镉的耐受能力是不同的，镉胁迫并未改变CAT转录和蛋白表达。

谷胱甘肽（GSH）在植物抵抗逆境胁迫过程中起着重要作用。研究报道，植物中的GSH可以螯合Cu和Cd，降低细胞内游离的重金属浓度，这些复合物随之转移到液泡并排出体外，从而减轻重金属对植物的毒害作用。拟南芥可能通过GSH途径参与调控Cd胁迫。

综上所述，CAT2不参与调控拟南芥根部对镉胁迫的耐受性，并且不参与ROS积累、生长素信号表达的调控。

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