高效液相色谱法测定茶鲜叶中18种游离氨基酸含量初探

董尚文 刘腾飞 董明辉

摘 要 建立了一种快速、灵敏、准确的柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测器测定茶鲜叶中18种游离氨基酸含量的方法。将茶鲜叶样品搅碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90 ℃水浴下浸提20 min，以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用Symmetry C18色谱柱梯度洗脱。以3倍信噪比计算方法的检出限，18种氨基酸的检出限为0.05～1.27 μmol·L-1。应用该方法检测了2个碧螺春茶鲜叶中18种氨基酸含量。结果表明，该方法简便、准确、快速、可靠。

关键词 茶鲜叶；游离氨基酸；柱前衍生化；高效液相色谱

中图分类号：TS272 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.11.071

茶是世界三大天然饮料之一，具有独特的香气、丰富的营养和保健功效[1-2]，深受消费者喜爱。茶叶中氨基酸的分析方法有很多，中国发明专利“利用反相高效液相色谱检测茶叶中游离氨基酸的方法”（专利号ZL201510109474.4）以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂，使用氨基酸专用分析柱进行梯度洗脱，结合反相高效液相色谱，实现了对茶叶中谷氨酰胺等19种氨基酸的定量分析。

本研究以茶叶鲜样代替茶叶干样作为样品，选用普通的Symmetry C18柱代替氨基酸分离专用柱，采用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为柱前衍生剂[3]，利用高效液相色谱-荧光检测器分离分析，实现了同时测定茶叶鲜样中18种游离氨基酸的目的，为开展茶叶质量评价、等级评定、指纹图谱构建提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 仪器与设备

2695高效液相色谱仪，配2475荧光检测器；TG16-WS台式高速离心机；K600粉碎机；LE-3000电热恒温水浴锅；Direct-Q 5 UV超纯水机。

1.1.2 药品与试剂

氨基酸标准品：天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和17种氨基酸混合标准品，衍生试剂为6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯；乙腈为色谱纯；实验用水为超纯水。

1.1.3 供试样品

茶叶鲜样取自苏州洞庭东山和西山碧螺春茶园。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

1）氨基酸标准溶液。精密称取各氨基酸标准品适量，置于25 mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容至刻度，得氨基酸单一标准溶液，其中茶氨酸浓度为12.5 μmol·L-1，于-20 ℃冰箱保存。

取17种氨基酸混合标液40 μL，加入40 μL 12.5 μmol·L-1茶氨酸标准溶液，用超纯水定容到1 mL，得到含茶氨酸的氨基酸混合标液，其中茶氨酸浓度为

500 μmol·L-1、胱氨酸为50 μmol·L-1，其余各氨基酸浓度均为100 μmol·L-1。

2）磷酸盐缓冲液。稱取19.0 g三水醋酸钠，1.72 g三乙胺溶于1 000 mL水，用磷酸调节pH至5.05，加适量EDTA，用0.45 μm滤膜过滤。

3）AQC衍生液。向AQC粉末瓶中加入1.25 mL乙腈，涡旋混合，在55 ℃条件下加热至溶解。

4）硼酸盐缓冲液。称取12.36 g硼酸，加400 mL水溶解，用400 g·L-1氢氧化钠溶液调pH至8.8，然后加水稀释至500 mL，得到0.4 mol·L-1硼酸盐缓冲液。

1.2.2 样品制备

取茶叶鲜样搅碎并混合均匀，称取0.25 g，加入10 mL沸水，在90 ℃的水浴锅中浸提20 min，冷却至室温后，3 000 r·min-1离心5 min，上清液加水定容10 mL，过0.45μm微孔滤膜后备用。

1.2.3 衍生化反应

准确移取10 μL标准品溶液或茶鲜叶样品溶液，置于自动进样瓶中，加入70 μL硼酸盐缓冲液，涡旋混合。取20 μL AQC衍生液，在涡旋状态下加入进样瓶中，涡旋混合10～20 s，静置1 min后在55 ℃下加热10 min，取出冷却至室温，供分析用。

1.2.4 仪器分离条件

色谱柱：Symmetry C18柱。柱温37 ℃，流速2.0 mL·min-1。荧光检测：激发波长250 nm、发射波长395 nm；进样量10 μL。流动相：A为磷酸盐缓冲液，按l∶10用超纯水稀释；B为100%乙腈；C为100%超纯水。梯度洗脱程序：0 min，100%A；0.5 min，98%A+2.0%B；0.5～9.0 min，96.5%A+3.5%B；9.0～

9.5 min，95.0%A+5.0%B；9.5～11.5 min，91.5%A+8.5%B；11.5～13.0 min，83.0%A+17.0%B（保持4 min）；17.0 min，60.0%B+40%C（保持2 min）；19～23 min，100%A。

1.2.5 定量测定

根据氨基酸标准品的保留时间对样品中的氨基酸定性，使用外标曲线计算样品中各氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 氨基酸标准溶液的色谱分离

18种氨基酸混合标液HPLC图谱如图1所示。从图1可以看出，氨基酸各组分之间的分离度良好，出峰紧凑且峰形对称，分析周期为23 min，在保证了分离效果的同时，实现了快速分析的目的和效果。

2.2 方法的回归方程、相关系数及检出限

配制浓度分别为5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、250 μmol·L-1的氨基酸混标溶液，衍生化后进样测定，结果表明，在5～250 μmol·L-1范围内，氨基酸的浓度与其峰面积的线性关系良好，相关系数为0.997 8～0.999 9。

2.3 方法回收率

精密称取0.25 g已知氨基酸含量的茶鲜叶样品5份，向其中加入一定体积的氨基酸混合标液，进行样品制备、衍生反应后测定，采用外标法定量，计算各氨基酸的回收率和RSD。

18种氨基酸的回收率在86.25%～109.05%，RSD在6.03%～10.56%，说明本方法准确度高，重现性好，方法可靠。

2.4 方法精密度

取适量含18种氨基酸的混合标液，按上述方法衍生后进样分析，连续进样5次，以色谱峰的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察其精密度。各氨基酸保留时间RSD在0.09%～0.55%，峰面积RSD在1.12%～2.15%，说明本方法精密度较高。

2.5 方法重复性

取同一茶鲜叶样品5份，按上述方法提取、衍生、测定，以色谱峰面积超过1%的氨基酸的保留时间和峰面积为指标分别计算RSD，考察方法的重复性。茶鲜叶所含氨基酸峰保留时间RSD在0.55%～1.98%，峰面积RSD在2.08%～3.71%，重复性较好。

2.6 方法稳定性

取同一茶鲜叶样品供试溶液，按照上述方法衍生，分别在0 h、4 h、8 h、12 h和24 h进样，以色谱峰峰面积超过1.0%的氨基酸的保留时间和峰面积为指标计算RSD，考察茶鲜叶中氨基酸衍生化溶液的稳定性。各氨基酸衍生化产物保留时间RSD在0.23%～2.01%（n=5），峰面积RSD在1.18%～3.91%（n=5）。表明氨基酸衍生化溶液在室温下可以稳定24 h。

3 方法应用

应用建立的方法，分别对苏州洞庭东山和洞庭西山的2个碧螺春茶叶鲜样中的游离氨基酸进行测定.

4 结论

建立了一种快速、灵敏、准确的柱前衍生-高效液相色谱-荧光检测器测定茶鲜叶中18种游离氨基酸含量的方法。将茶鲜叶样品搅碎混匀，以超纯水作为萃取溶剂，在90 ℃水浴下浸提20 min，以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯为衍生剂柱前衍生化，使用Symmetry C18色谱柱梯度洗脱。同时，Symmetry C18柱价格便宜，专属性不强，可以用于其他物质的检测，大大节约分析的成本，特别适合在广大基层检测机构和单位推广使用。

参考文献：

[1] 张庆，陈祥贵，李晓霞，等.茶的保健作用研究进展[J].中国食物与营养，2005（9）：38-41.

[2] 肖玫，楊丽琴，刘晓明，等.茶叶的营养与保健价值及其开发利用[J].中国食物与营养，2005（12）：23-24.

[3] 李梅，刘金华，楼兵干，等.植物鲜样中游离氨基酸提取方法的比较[J].实验室研究与探索，2016，35（4）：34-38.

（责任编辑：赵中正）