细管类型和距液氮面高度对猪精液冷冻保存效果的影响

薛琦

摘 要：本试验探究了细管类型和细管距离液氮面高度对猪精液冷冻保存冻后存活率的影响。试验结果表明：（1）0.5 mL细管冷冻保存猪精子的冻后存活率极显著（P<0.01）高于0.25 mL细管冷冻保存猪精子的冻后存活率，0.5 mL细管组的冻后存活率为0.55±0.050，而0.25 mL细管组的冻后存活率为0.43±0.044 7。（2）距液氮面1.638 cm处冷冻保存猪精液得到的冻后存活率显著（P<0.05）高于距液氮面2.162 cm处冷冻保存精液得到的冻后存活率。距液氮面1.638 cm时，冻后精子的存活率为0.58±0.130，距液氮面2.162 cm时，冻后精子的存活率为0.41±0.074。

关键词：细管类型；距液氮面高度；猪精液；冷冻保存；精子存活率

中图分类号：S828 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2018）04-0057-04

在猪生产中，由于猪精子对低温更加敏感，猪输精量大和猪精液常温保存较为成功，使得猪精液冷冻保存的研究和应用停滞不前，严重地影响了种公猪优良性能的充分发挥。近些年来，随着低温生物学以及犬、牛等动物精子冷冻保存技术的发展，现在对于猪精液冷冻保存的研究明显增多，冷冻保存效果显著提高，解冻后精子存活率超过0.5的研究报道比比皆是[1]。冷冻保存于液氮中的精子，其细胞代谢几乎完全停止，理论上可以实现精子的长期保存，便于精液的长途运输和交流，有利于良种的快速扩繁，对推动养猪业的发展具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 猪新鲜精液采集

本实验采集长白种公猪的新鲜精液，保证鲜精活率在0.85以上。种公猪来至静宁县四方种猪场。种公猪体格健壮，生殖能力正常。

1.1.2 仪器设备

离心机（型号GTL-20bR，上海飞鸽离心机有限公司产品），普通生物显微镜（型号XSP-2C，上海巴拓仪器有限公司产品），电暖器（型号NSA-7a，珠海格力电器股份有限公司），水浴锅（型号HWS-12，上海一恒电器厂），移液器（规格100 μL～1 000 μL，北京智杰方远科技有限公司），普通冰箱（型号：BCD-618W，海信科龙电器股份有限公司）。

1.1.3 试剂

Tris（货号ZZ02531，Novon公司进口分装产品），葡萄糖（分析纯，批号20150603，山东浩中化工科技有限公司生产），柠檬酸（分析纯，批号20140505，廊坊鹏彩精细化工有限公司生产），注射用青霉素钠（批号H20143045，润泽制药有限公司产品），注射用硫酸链霉素（兽用，批号H37021948，瑞阳制药有限公司产品）。

卵黄：自制。取新鲜鸡蛋，用酒精棉球对蛋壳表面进行消毒，然后在大头处打破蛋壳去除蛋清，均匀混合即可。

2 试验方法

2.1 稀释液制备

按表1，分别称取Tris 3.04 g、葡萄糖 1.25 g、柠檬酸1.3 g、青霉素0.06 g、硫酸链霉素0.10 g，加入含有超纯水的烧杯中，旋转摇动烧杯，使加入的各种成分充分溶解并均匀混合，然后用100 mL容量瓶定容。定容后的基础稀释液放入17 ℃恒温箱中待用。

稀释液Ⅰ由80 mL基础稀释液和20 mL卵黄混合而成。

稀释液Ⅱ则为含有6%甘油的稀释液Ⅰ。

2.2 鲜精的采集及运输

手握法采集豬的精液，盛于100 mL的塑料瓶，在1 h～2 h内用毛巾包裹送回实验室，放置在17 ℃的恒温箱中保存备用。运输过程中要避免精液出现温度的下降，还应防止精子的剧烈震荡，以免影响精子的质量。

2.3 鲜精和稀释液的温度平衡

将猪鲜精液和配置好的稀释液I放入17 ℃的恒温箱中2 h进行平衡，使稀释液Ⅰ和鲜精温度保持一致，达到一个温度的平衡，为接下来的精液稀释做好准备。

2.4 鲜精的稀释和降温

取平衡好温度的猪精液4 mL于塑料指管中，用离心机2 000 r/min离心4 min，去除上清液；加入2 mL稀释液Ⅰ，2 000 r/min离心 4 min，去上清液；加入4 mL稀释液I，均匀混合后用药棉封口，放入含有4 00 mL 17 ℃水的烧杯中，一起放入4 ℃的冷藏室过夜。同时，也将稀释液Ⅱ放至冷藏室降温平衡。

2.5 抗冻保护剂的平衡

按照等温等量的原则，将过夜的稀释液Ⅱ缓慢加入也已降温至4 ℃的精液中，均匀混合后，放入冷藏室继续平衡2 h～4 h。

2.6 猪精液的分装

将精液吸入已降温至4 ℃的0.5 mL的细管中，使精液吸至细管中部。每次分装时应保证细管中精液长度大致相等，且整个分装过程应在4 ℃条件下进行。

2.7 猪精液的冷冻和解冻

选取大小适中的泡沫塑料箱，倒入液氮至泡沫塑料箱容积的一半，放入特制的厚度为2.162 cm 或1.638 cm的泡沫塑料船。然后将分装好的细管放置在塑料泡沫船上，盖上泡沫箱，熏蒸10 min后，将细管投入液氮中冷冻保存2 min。冷冻结束后，用镊子夹住细管一端（避免夹住装有精液的细管中部），迅速放入45 ℃的水浴锅中进行解冻10 s，解冻时防止水浴锅中的水进入细管。

2.8 精子活率的检查

解冻后的精液首先在37 ℃恒温箱中放置 5 min，然后取1滴滴于载玻片上，盖上盖玻片，盖玻片和载玻片均已在37 ℃恒温箱中平衡温度。然后将其置于显微镜下观察存活率。观察时至少观察5个不同视野，每个视野观察10个精子，并记录存活精子数，算出精子存活率。活率检测应尽量快，且选择盖玻片中间部位的视野进行测定。

3 数据处理

本试验用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，并进行差异的F检验。所有数据均用“平均数±标准差”来表示。

4 结果与分析

4.1 细管类型对猪精子冻后存活率的影响

在其他因素完全相同的情况下，我们仅就细管类型这个单一因素进行了试验。由表2和图1可知，在进行5次重复试验后得到冻后精子存活率，0.5 mL细管组精子存活率平均为0.55±0.050，而0.25 mL细管组精子存活率平均为0.43±0.044 7。显著性检验结果表明： 0.5 mL细管冷冻保存猪精液的精子存活率极显著（P<0.01）高于使用0.25 mL细管冷冻保存猪精子的冻后存活率。可以看出，0.5 mL细管冷冻保存猪精液的效果要好于0.25 mL细管。

4.2 距液氮面高度对猪精子冻后存活率的影响

在其他因素完全相同的情况下，我们还对细管距液氮面的高度这个单一因素进行了试验。从表3和图2中得出，用0.25 mL细管时，距液氮面上方1.638 cm冷冻保存猪精液得到的冻后精子存活率显著（P<0.05）高于距液氮面2.162 cm处冷冻保存得到的冻后精子存活率。距液氮面1.638 cm时，冻后精子的存活率为0.58±0.130，距液氮面2.162 cm时，冻后精子的存活率则为0.41±0.074。与距液氮面上方2.162 cm相比，距液氮面1.638 cm处冷冻保存猪精液的效果会更好。

5 讨论

5.1 细管类型对猪精液冷冻保存效果的影响

目前常用的细管规格有0.25 mL、0.5 mL和5 mL，通常规格小的冷冻保存效果较好。Bwanga等[2]研究发现，0.25 mL细管冻后精子活率明显高于5 mL细管中精子的活率。Simmet等也对细管进行过对比研究，从冻后的精子活率以及顶体完整性等指标来看，0.25 mL和0.5 mL细管的冷冻保存效果都明显优于5 mL细管。

有关0.25 mL和0.5 mL细管间的比较研究则不多。从我们在-80 ℃的超低温冰箱的冷冻保存研究结果来看，45 ℃×5 s解冻条件下，0.25 mL和0.5 mL的细管冷冻保存的猪精子，其冻后存活率之间没有明显的差异（P>0.05）。本研究则将猪的精液冷冻保存于-196℃的液氮中进行试验的，结果发现0.5 mL细管冷冻保存猪精液的精子存活率极显著（P<0.01）高于使用0.25 mL细管冷冻保存猪精液的精子存活率，0.5 mL细管冷冻保存的猪精子冻后存活率为0.55±0.050，使用0.25 mL细管冷冻保存的猪精液冻后存活率为0.43±0.044 7。可能是在 -80 ℃冷冻保存时，0.25 mL细管保存的猪精液在冷冻解冻过程中能够更快地通过冰晶形成的高危区；而-196 ℃冷冻保存时，0.5 mL细管保存的猪精液在冷冻解冻过程中更快通过冰晶形成的高危温度区所致。

5.2 距液氮面高度对猪精液冷冻保存效果的影响

我们知道，细胞冷冻过程中冰晶是造成细胞损伤和死亡的主要原因。冰晶形成的温度区域是0～-60 ℃。在这一区域降温速度越慢，形成的冰晶越大，对细胞的损害也越大。因此，在进行冷冻保存降温时应快速通过危险温度区而进入损害较小的玻璃化温度区（-60 ℃～-250 ℃）。

精子需要在冷冻过程中控制好溫度的下降，总的来说，在冰晶形成的危险温度区，降温的速度要快，而在玻璃化的温度区，降温的速度则要慢。传统的精子冷冻方法，即将细管精液置于液氮面上方2 cm～3 cm处用液氮熏蒸冷冻，正是实现快速通过冰晶形成的温度区和缓慢通过玻璃化温度区的具体举措。细管精液距液氮面越近，温度下降的就越快，通过冰晶形成的温度区加快了，但通过玻璃化的温度区的速度也加快了，这会造成破裂损伤，也会引起精子的死亡；细管精液距液氮面越远，温度下降的就越慢，通过玻璃化的温度区的速度变慢了，这会通过冰晶形成的温度区也变慢了，这会造成冰晶形成的增加，也加大了精子的损伤和死亡。为了寻找一个较为合适的距液氮面的高度，获得猪精液更好的冷冻保存效果，我们设计了1.638 cm 和2.162 cm两种高度进行了对比研究，结果表明，液氮面上方1.638 cm处冷冻保存的猪精子冻后存活率（0.58±0.130）显著（P<0.05）高于液氮面上方2.162 cm处冷冻保存的猪精子冻后存活率（0.41±0.074）。

6 结论

（1）0.5 mL细管冷冻保存猪精液的冻后存活率明显要好于0.25 mL细管。

（2）与液氮面上方2.162 cm相比，液氮面上方1.638 cm冷冻保存的猪精液，其冻后精子存活率显著提高。

参考文献：

[1] 张铁刚，李然. 影响猪人工授精效果的主要因素[J]. 黑龙江动物繁殖，2013，21（6）：23-25.

[2] Hernandez M，Roca J，Calvete J J， Sanz L，Muino-Blanco T，Cebrian-Perez J A，Va Zquez J M，Martinez E. Cryosurvival and invitro fertilizing capacity post thaw is improved when boar spermatozoaare frozen in the presence of seminal plasma from good freezer boars. Journal of Andrology， 2007，28：690-697.